310 Componente químico de tubo flexible de acero inoxidable de 10 * 1 mm. Los dominios N-terminales de la espidroína forman hidrogeles basados ​​en fibrillas de amiloide y proporcionan una plataforma para la inmovilización de proteínas.

Gracias por visitar Nature.com.Está utilizando una versión del navegador con soporte CSS limitado.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador actualizado (o deshabilite el Modo de compatibilidad en Internet Explorer).Además, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.
Controles deslizantes que muestran tres artículos por diapositiva.Utilice los botones Atrás y Siguiente para moverse por las diapositivas, o los botones del controlador de diapositivas al final para moverse por cada diapositiva.

Especificación

310 proveedores de tubos en espiral de acero inoxidable de 10 * 1 mm

Composición química

Propiedades mecánicas

Las proteínas de seda de araña recombinantes (proteínas de seda de araña) tienen muchas aplicaciones potenciales en el desarrollo de nuevos biomateriales, pero su naturaleza multimodal y propensa a la agregación las hace difíciles de obtener y fáciles de usar.Aquí informamos que las proteínas recombinantes de espidroína en miniatura y, lo que es más importante, el propio dominio N-terminal (NT) forman rápidamente hidrogeles transparentes y autosoportados a 37 ° C.Las proteínas de fusión que consisten en NT y proteína fluorescente verde o purina nucleósido fosforilasa forman proteínas de fusión completamente funcionales.Hidrogeles.Nuestros resultados muestran que las proteínas NT y de fusión recombinantes proporcionan altos rendimientos de expresión y dotan a los hidrogeles de propiedades atractivas como transparencia, gelificación sin entrecruzamiento e inmovilización directa de proteínas activas a alta densidad.
Las arañas tienen hasta siete conjuntos diferentes de glándulas de seda, cada una de las cuales produce un tipo específico de seda.Las siete especies de seda están compuestas de proteínas de seda de araña (espidroínas) de aproximadamente 6000 residuos de largo y contienen una gran región central repetida rodeada por dominios esféricos N y C terminales (NT y CT)1,2.El tipo de seda más estudiado, la ampolla primaria, es producida por la glándula de la ampolla primaria.En esta glándula, una monocapa de células epiteliales sintetiza proteínas espidroína y las secreta en la luz de la glándula, donde están presentes en forma soluble (dopaje) en concentraciones extremadamente altas (30-50% p/v)3,4.Se ha debatido la organización y conformación de las principales proteínas ampulares espidroína en la glándula, pero la mayoría de la evidencia experimental indica la presencia de una conformación helicoidal generalmente helicoidal y/o aleatoria y estructuras micelares o laminares5,6,7,8,9,10.Mientras que los dominios repetitivos regulan las propiedades mecánicas de las fibras de seda, formando nanocristales de láminas β y estructuras amorfas11,12,13,14,15, los dominios finales regulan las fibras de seda en respuesta a las condiciones cambiantes a lo largo de la glándula de la seda16,17,18.Al controlar la formación de seda, 19. Los dominios terminales se conservan evolutivamente y su función puede ser común a todas las proteínas espidroína 2,20,21.Durante el paso a través de la glándula, el pH de la espidroína disminuye de aproximadamente 7,6 a < 5,716 y aumenta con el corte y el estiramiento mediados por el movimiento a través del conducto que se estrecha gradualmente.En solución, CT es un dímero paralelo constitutivo de hélice α17, pero en respuesta al pH bajo y a fuerzas de corte, CT se despliega y cambia las capas β16, 17, lo que posiblemente desencadena capas β en las regiones repetitivas del Convert 16. Las NT son monoméricas en condiciones condiciones que reflejan las condiciones en la luz de la glándula y median la solubilidad de la espidroína, pero a pH reducido, la protonación de varias cadenas laterales de ácido carboxílico conduce a la dimerización de NT con un pKa de aproximadamente 6,5, estabilizando así la NT y fijando la espidroína en gran medida. cantidades.redes16,18.Así, la NT juega un papel clave en la formación de filamentos, pasando de un monómero en el recubrimiento a un dímero en la fibra23,24,25.La NT sigue siendo altamente soluble y helicoidal en todas las condiciones estudiadas hasta la fecha16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, lo que inspiró su desarrollo como una etiqueta que mejora la solubilidad para la producción de proteínas heterólogas.
La miniproteína de seda de araña recombinante, que consta de una NT, una región de repetición corta, una CT y una etiqueta His6 (His-NT2RepCT) para la purificación, es tan soluble en tampón acuoso como la proteína de seda de araña nativa e imita importantes características nativas de la araña de seda. .cobertura 25.31.His-NT2RepCT se puede hilar en fibras continuas utilizando una máquina biomimética en la que se extruye un recubrimiento soluble de pH 8 en un baño de agua de pH 525,32,33,34,35.La fermentación en biorreactor de E. coli que expresa His-NT2RepCT y el posterior tratamiento posterior dieron como resultado un rendimiento >14 g/l después de la purificación.El alto rendimiento, la alta solubilidad y la respuesta adecuada de His-NT2RepCT a condiciones ácidas se atribuyen a NT23, 25, 34.
Aquí informamos la rápida formación de hidrogeles transparentes a partir de proteínas de espidroína recombinantes, incluida la NT sola, mediante la incubación de una solución de proteína a 37 ° C.Utilizando fluorescencia de tioflavina T (ThT), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) y microscopía electrónica de transmisión (TEM), encontramos que las proteínas NT y microaraña experimentan una transformación estructural en láminas β y fibrillas similares a amiloide. cuando se forman geles.Además, las proteínas de fusión de NT y la proteína fluorescente verde (GFP) o la purina nucleósido fosforilasa (PNP) forman hidrogeles con fragmentos de fusión completamente funcionales.La expresión de alto rendimiento en huéspedes heterólogos, junto con la rápida formación de hidrogeles en condiciones fisiológicas, abre la posibilidad de una producción rentable de hidrogeles con funciones diseñadas.
A diferencia de la mayoría de las proteínas espidroína recombinantes36, His-NT2RepCT es estable en tampón Tris-HCl a pH 8 y puede concentrarse hasta 500 mg/ml sin precipitación25.Por lo tanto, nos sorprendió descubrir que esta proteína forma rápidamente hidrogeles autoportantes, ópticamente transparentes, cuando se incuba a 37 ° C (Fig. 1b-d).Estudios adicionales demostraron que la gelificación de His-NT2RepCT se produjo en un amplio rango de concentraciones de proteínas (10 a 300 mg / ml) y que esta concentración se correlacionó inversamente con el tiempo de gelificación (Fig. 1c y Fig. 1 complementaria).Para descubrir qué partes de His-NT2RepCT median en la formación de hidrogel, luego examinamos cada dominio individualmente y en varias combinaciones utilizando un ensayo de inversión en matraz (Figura 1a, b).Todas las fracciones analizadas de espidroína recombinante formaron geles (a una concentración de proteína de 300 mg / ml) en menos de 1 h, excepto el 2Rep precipitado (Fig. 1b).Esto sugiere que NT y CT solos, en combinación o asociados con repeticiones, pueden gelificarse a 37°C y que la etiqueta His6 no afecta este proceso de manera significativa.Dada la noción común de que la NT es una proteína altamente soluble y estable, y que informes anteriores de hidrogeles de espidroína recombinantes han atribuido efectos de gelificación a cambios conformacionales en regiones repetidas y/o CT, la propia NT podría hacerlo.El descubrimiento de la gelificación fue inesperado.Tabla complementaria 1) 37, 38, 39. Sorprendentemente, la NT ya se gelificó en 10 minutos a una concentración de ≥ 300 mg/ml (Fig. 1c).Los experimentos de inversión de viales con diversas concentraciones de NT mostraron que a >50 mg/ml la solución de NT gelificó más rápido que His-NT2RepCT a la concentración correspondiente (p/v, Figura 1c).
Representación esquemática de varias construcciones de espidroína estudiadas en este trabajo.b Tiempo de gel a 37 °C para diversas proteínas espidroína recombinantes (300 mg/ml) verificado invirtiendo el vial.Gel CT inmediatamente sin incubación (<300 mg/mL), precipita 2Rep (300 mg/mL, escala de 5 mm).c Tiempo de gel de His-NT2RepCT y NT a las concentraciones de proteína indicadas a 37 °C.d Fotografías de hidrogeles His-NT2RepCT y NT con la araña y la letra “NT” impresas debajo, respectivamente (ambos 200 mg/mL, barra de escala 5 mm).
Los hidrogeles formados por varias proteínas espidroína recombinantes tienen colores ligeramente diferentes y la observación a simple vista muestra distintos grados de transparencia (Fig. 1b).Los geles NT son excepcionalmente claros, mientras que otros geles se vuelven opacos.Los geles His-NT2RepCT y NT moldeados en tubos cilíndricos se pudieron retirar del molde intactos (Fig. 1d).
Para probar si los recubrimientos naturales de seda de araña se gelifican en condiciones que ahora causan la gelificación de las proteínas espidroína recombinantes, se recolectaron recubrimientos de la gran glándula ampolla de la araña puente sueca (Larinioides sclopetarius).Los recubrimientos se almacenaron en tampón Tris-HCl 20 mM a 50 mg/ml (basado en el peso seco medido), pero no se observó gelificación durante los 21 días de incubación a 37 °C (Figura 2a complementaria).
Para cuantificar estos geles, se pueden utilizar mediciones reológicas para estudiar el proceso de gelificación y determinar las propiedades mecánicas generales.En particular, el seguimiento del módulo de almacenamiento (elasticidad) a temperaturas elevadas puede proporcionar información sobre la temperatura de gelificación así como sobre las propiedades viscoelásticas del recubrimiento.Los experimentos de aumento de temperatura (utilizando 1 °C/min a 25-45 °C, basados ​​en estudios previos que utilizaron soluciones madre de seda natural)40,41 mostraron que los módulos de almacenamiento de las soluciones His-NT2RepCT y NT aumentaron con el aumento de la temperatura.se incrementó (Fig. 2 y Fig. 3 complementaria).En particular, el módulo NT comenzó a crecer a una temperatura más baja en comparación con His-NT2RepCT, lo que coincide con el tiempo de gel más rápido observado cuando NT se incubó directamente con His-NT2RepCT a 37 °C (Figura 1).Después de una caída posterior de la temperatura, el módulo de almacenamiento no volvió a valores más bajos y permaneció por encima del módulo de pérdida (consulte la figura complementaria 3), lo que indica una gelificación estable térmicamente irreversible.Después de la gelificación, el módulo elástico final osciló entre 15 y 330 kPa para los hidrogeles His-NT2RepCT a una concentración de 100 a 500 mg/ml, y el módulo elástico final para los hidrogeles NT (100 a 500 mg/ml) osciló entre 2 y 1400. kPa (Fig., 2 y datos completos de la rampa) consulte la Fig. complementaria 3).
a Cambio de temperatura durante las mediciones de His-NT2RepCT (300 mg/mL) yb NT (300 mg/mL) con agitación.Las flechas indican la tendencia de la temperatura y el sombreado más claro de los datos del módulo de almacenamiento muestra las pruebas con valores de torque más bajos para el instrumento que los especificados por el fabricante, que es la causa del aumento de ruido.c Acumulación del módulo final de His-NT2RepCT y NT después de temperatura elevada (100, 300 y 500 mg/ml).Todas las lecturas del módulo se toman a una frecuencia de 0,1 Hz.
Como método potencial para investigar los cambios conformacionales asociados con la gelificación, registramos espectros FTIR de His-NT2RepCT y NT antes y después de la gelificación a 37 ° C (Figura 3a, b).Como se esperaba, los espectros de las soluciones His-NT2RepCT y NT correspondieron a proteínas que mostraban una estructura secundaria de hélice α/bobina aleatoria, con una banda pronunciada a 1645 cm-1.Para ambos hidrogeles, la gelificación resultó en la formación de dos brazos en la banda I media a aproximadamente 1617 cm-1 y 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), lo que indica la formación de estructuras de lámina β antiparalelas.Estos cambios también se pueden ver claramente en los respectivos espectros de gelificación de diferencia y segunda derivada (Figura complementaria 4b).Las dos bandas de la capa β de NT eran más pronunciadas que las de His-NT2RepCT, lo que indica que el contenido total de bandas de la capa β en el hidrogel de NT era mayor que el del hidrogel de NT2RepCT.
a espectros de absorción FTIR de His-NT2RepCT yb NT (ambos 500 mg/ml) antes (solución) y después (gel) de la incubación a 37 °C.c Imágenes TEM de geles NT2RepCT de 50 mg/ml resuspendidos y d NT.Barra de escala 200 nm.e Diámetros de fibra de hidrogeles His-NT2RepCT y NT.n = 100 fibrillas medidas, p < 0,0001.Las barras de error muestran la desviación estándar.El centro de las barras de error es la media.Se utilizó una prueba t no apareada (de dos colas) para el análisis estadístico.f Fluorescencia ThT de varias proteínas espidroína recombinantes (100 mg/ml) a 37 °C sin agitación.Experimentos de inoculación de g NT (100 mg/mL) a partir de gel de NT de 100 mg/mL con 0%, 5%, 10% y 20% de semillas.
El análisis del gel mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró que el hidrogel consta de fibrillas similares a amiloide (Figs. 3c, 3d).Las fibrillas formadas por NT eran alargadas (5 a 12 nm de diámetro) y no ramificadas, mientras que las fibrillas His-NT2RepCT eran más cortas en longitud y significativamente más anchas en diámetro (7 a 16 nm) (Fig. 3e).Estos resultados nos permitieron seguir la cinética de la fibrosis utilizando el ensayo de tioflavina T (ThT).Para todas las proteínas recombinantes de espidroína, la señal fluorescente aumentó cuando las muestras se incubaron a 37 ° C (Fig. 3f, Fig. Suplementaria 5a).De acuerdo con este hallazgo, el examen microscópico de NT y His-NT2RepCT en condiciones de gelificación reveló un aumento uniforme en la fluorescencia de ThT sin una acumulación local notable de agregados positivos para ThT (Figuras complementarias 5b, c).La formación de fibrillas ThT positivas no estuvo acompañada por un aumento en la turbidez de NT y His-NTCT (Figura complementaria 5d), lo que significa que se podría formar una red de fibrillas en el gel sin comprometer la claridad del gel.La siembra mediante la adición de pequeñas cantidades de fibrillas preformadas puede acelerar significativamente la formación de fibrillas de algunos amiloides42,43,44 pero agregando 5%, 10% o 20% (p/p) de NT a una solución de hidrocoagulantes de NT.efecto de siembra (Fig. 3g).Quizás esto se deba al hecho de que las fibrillas del hidrogel están relativamente fijas y no pueden usarse como semillas.
El comportamiento inesperado de las proteínas espidroína recombinantes a altas temperaturas impulsó más estudios de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para identificar cambios conformacionales asociados con la formación de gel.Los espectros de RMN de las soluciones His-NT2RepCT registradas a lo largo del tiempo a 37 ° C mostraron que CT todavía estaba parcialmente plegada, mientras que las señales NT y 2Rep habían desaparecido (Fig. 4a), lo que sugiere que fueron principalmente NT y 2Rep los que controlaron parcialmente la formación de His-NT2RepCT. Hidrogel NT2RepCT.La señal de CT también se atenuó al 20% de su intensidad original, lo que sugiere que la CT también está mayoritariamente fija e incorporada a la estructura del hidrogel.Para una porción más pequeña de la CT, que es tan móvil como en la muestra preincubada y, por lo tanto, se observa mediante RMN en solución, los espectros carecen de señales para los primeros 10 residuos estructurados, posiblemente debido a la difícil inmovilización de la porción adjunta de His-NT2Rep.Los espectros de RMN del estado de los hidrogeles -NT2RepCT revelaron la presencia predominante de hélices α y capas β y, en menor medida, la conformación de espiral aleatoria (Fig. 4b).El análisis de desplazamiento químico de los residuos de metionina presentes sólo en NT mostró que este dominio se había convertido en una estructura de hoja β.Los espectros de NT en solución dependientes del tiempo mostraron una disminución uniforme en la intensidad de la señal (Fig. 4c), y la RMN en estado sólido de hidrogeles de NT mostró que la mayoría de los residuos de NT se convirtieron en estructuras de láminas β (Fig. 4d).La conformación de 2Rep no se pudo determinar por separado debido a su tendencia a agregarse.Sin embargo, los espectros de RMN de estado sólido de los hidrogeles NTCT y His-NT2RepCT parecían muy similares (Fig. 4b; Fig. complementaria 6b), lo que sugiere que 2Rep contribuyó poco a la parte estructural del hidrogel His-NT2RepCT.Para los hidrogeles CT, se encontró que existían hélices α, láminas β y estructuras secundarias helicoidales aleatorias (Figura complementaria 6d).Esto sugiere que algunas partes del CT siguen siendo hélices α mientras que otras se convierten en láminas β.Por lo tanto, los resultados de la espectroscopia de RMN sugieren que la NT es importante para la formación de hidrogel y también se transforma en una conformación de lámina β tras la fusión con 2Rep y CT.De acuerdo con esto, recientemente descubrimos que es probable que se formen cremalleras espaciales de amiloide en las cinco hélices del dominio NT, y el algoritmo de Waltz predijo una región amiloidogénica en la hélice 1 (Fig. 4e).
Espectros 2D de la solución His-NT2RepCT de 15N-HSQC de 10 mg/ml antes (azul) y 19 horas después de la incubación (rojo) a 37°C.Los picos cruzados individuales en el espectro rojo y F24, G136, poliA en el espectro azul se indican mediante símbolos de aminoácidos de una sola letra y números de residuos.Los recuadros muestran la dependencia de la intensidad de la señal en el tiempo para residuos seleccionados de los dominios NT, 2Rep y CT.b Espectros de radiofrecuencia de estado sólido (RFDR) de hidrogeles His-NT2RepCT.Las correlaciones de los residuos Cα/Cβ observados en los espectros RFDR se determinaron comparándolos con los cambios químicos del péptido modelo y los valores derivados de estadísticas82,83 y sus estructuras secundarias.SSB – banda lateral giratoria.c Espectros unidimensionales de solución NT 15N-HSQC de 10 mg/ml durante la incubación a 37 °C durante 36 horas.El recuadro muestra la intensidad volumétrica versus el tiempo.d Espectros RFDR de estado sólido de hidrogeles NT.Se indican las correlaciones de los residuos Cα/Cβ y sus estructuras secundarias observadas en los espectros RFDR.e Basado en el perfil de propensión a la fibrilación NT45.79 de la base de datos Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).La energía de Rosetta de la ventana espacial de desplazamiento del rayo del hexapéptido se muestra en kcal/mol.Las barras rojas indican hexapéptidos con una alta propensión a la fibrosis (energía de Rosetta inferior a -23 kcal/mol; debajo de la línea de puntos).Las barras verdes indican fragmentos con energías de Rosetta por encima del umbral y, por lo tanto, es menos probable que formen cremalleras estéricas.Se excluyeron del análisis los fragmentos que contenían prolina (sin columnas).Los cuadrados indican áreas de amiloidosis predichas por el algoritmo de Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).La secuencia de residuos de aminoácidos de NT está en la parte superior y los tipos de residuos que se encuentran en la estructura secundaria β (determinada por espectroscopia de RMN de estado sólido) se muestran en rojo.Las posiciones de las cinco hélices α NT se denominan (H1-H5)28.
A pH <6,5, el HT se dimeriza, siendo resistente a la desnaturalización inducida por calor o urea18.Para dilucidar cómo la dimerización y la estabilidad de NT afectan la gelificación, se controlaron soluciones que contenían 100 mg/ml de NT a pH 8, 7 y 6 mediante la prueba de inversión del vial.Las muestras de NT incubadas a pH 8 y 7 se gelificaron después de 30 minutos a 37 °C, pero el gel de pH 8 permaneció claro, mientras que el gel de pH 7 mostró un precipitado visible (Fig. 5a).Por el contrario, una solución que contenía HT a pH 6 no formó un gel y se pudo observar un gran precipitado después de 20 minutos a 37°C.Esto sugiere que los propios dímeros y/o su mayor estabilidad en comparación con los monómeros previenen la gelificación.No se esperaba la formación de un precipitado de NT a pH 7 y 6, ya que se ha informado que la NT es soluble a 200 mg/ml27, se repliega fácilmente después de la desnaturalización por calor y también retiene una hélice α a valores más bajos de pH 18. Una explicación probable para estas discrepancias es que los experimentos informados anteriormente se llevaron a cabo a temperatura ambiente o menos, o a concentraciones de proteína relativamente bajas16,18,19.
Prueba de inversión de viales de NT (100 mg/mL) a pH 8, 7, 6 y NaCl 154 mM (pH 8) después de la incubación a 37°C.b Espectros de NT CD con y sin NaF 154 mM y NaCl 154 mM, respectivamente.La elipticidad molar a 222 nm se convierte en una proporción de pliegues naturales.c Ensayo de inversión de NT (100 mg/mL) NT* (37 °C y 60 °C), NTA72R (37 °C) y His-NT-L6 (37 °C y 60 °C).d Espectros de CD de los mutantes NT NT*, NTA72R y His-NT-L6.La elipticidad molar a 222 nm se convierte en una proporción de pliegues naturales.e Prueba de inversión de NTFlSp, NTMiSp y NTMiSp reducida (100 mg/mL).Barra de escala de 5 mm.f Espectros CD de NT, NTFlSp, NTMiSp y NTMiSp reducido.La elipticidad molar a 222 nm se convierte en una proporción de pliegues naturales.Los espectros NT completos a 25 °C y 95 °C se muestran en la Figura complementaria 8.
La concentración de sal fisiológica determina las interacciones electrostáticas entre las subunidades de NT y la dimerización de la transferencia de NT a un pH más bajo18.Descubrimos que la presencia de NaCl y NaF 154 mM efectivamente inhibió la gelificación, respectivamente (Fig. 5a, b; Fig. 2b complementaria) y que estas sales aumentaron la estabilidad térmica de los monómeros NT (Fig. 5b, Fig. 8 complementaria). .También sugiere que la mejora de la estabilidad, en lugar de la dimerización, previene la formación de gel.
Para explorar más a fondo el papel de la dimerización y estabilidad de las proteínas en la gelificación, utilizamos dos mutantes, NT* y NTA72R, que también permanecen monoméricos a un pH bajo de 28,30.NT* es un mutante de inversión de carga doble en el que la distribución de carga dipolar aparente del monómero se aplana, lo que evita la dimerización y aumenta drásticamente la estabilidad del monómero.NTA72R es un dipolo cargado, pero el Ala sustituido con Arg se encuentra en el límite del dímero, por lo que las mutaciones interfieren con las interacciones de las subunidades necesarias para la dimerización.Tras la incubación a 37 ° C, NT* no formó un hidrogel, mientras que NTA72R formó un gel opaco durante 15 minutos (Fig. 5c).Dado que tanto NT * como NTA72R no pueden dimerizarse pero difieren en la estabilidad del monómero (Fig. 5d), estos resultados sugieren fuertemente que la alta estabilidad termodinámica evita que NT se gelifique.Esto también está respaldado por el hecho de que HT* forma un gel cuando es inestable a alta temperatura (después de 8 min a 60 °C; Fig. 5c).Anteriormente se ha demostrado que el alto contenido de metionina en NT licua su plegamiento natural y que seis sustitutos de Met a Leu (denominados aquí His-NT-L6) estabilizan fuertemente el monómero NT46.Partiendo del supuesto de que se requiere flexibilidad estructural para la formación del gel NT, encontramos que el mutante estable His-NT-L6 no gelificó a 37 °C (Figura 5c, d).Sin embargo, His-NT-L6 también formó un gel tras la incubación a 60 ° С durante 60 min (Fig. 5c).
La capacidad de la NT para transformarse en estructuras de láminas β y formar hidrogeles parece aplicarse a algunos, pero no a todos, los dominios NT de la espidroína.Las NT de diferentes tipos de seda y especies de arañas, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formaron geles a pesar de su contenido relativamente bajo de metionina y su alta estabilidad térmica (Fig. 5e, f y Tabla complementaria 2).Por el contrario, la NT de la proteína ampular pequeña espidroína de Araneus ventricosus (NTMiSp) con baja estabilidad térmica y alto contenido de metionina no formó hidrogeles (Tabla complementaria 2 y Fig. 5e, f).Esto último puede estar asociado a la presencia de enlaces disulfuro intramoleculares29,47.Consistentemente, cuando se redujeron los enlaces disulfuro de NTMiSp, se formó un hidrogel después de la incubación a 37 ° C durante 10 minutos (Fig. 5e).En conclusión, cabe señalar que la flexibilidad estructural es un criterio importante, pero no el único, para la formación de un gel a partir de NT.Otro factor que puede ser relevante es la propensión a formar fibrillas de amiloide, y el análisis con la base de datos Zipper y el algoritmo Waltz sí mostró una correlación entre la capacidad de formar geles y la presencia de regiones amiloidogénicas, así como la extensión de las regiones predichas. para formar cremalleras estéricas.Hubo una correlación (Tabla complementaria 2 y Figura complementaria 9).
La capacidad de NT para formar fibrillas y geles en condiciones favorables nos llevó a plantear la hipótesis de que las fusiones de NT con otros fragmentos de proteínas aún pueden formar geles con la función completa de los socios de fusión.Para probar esto, introdujimos la proteína fluorescente verde (GFP) y la purina nucleósido fosforilasa (PNP) en el extremo C del NT, respectivamente.Las proteínas de fusión resultantes se expresaron en E. coli con rendimientos finales muy altos (cultivos en matraz agitado de 150 mg/l y 256 mg/l para His-NT-GFP y His-NT-PNP, respectivamente), de acuerdo con lo que se ha demostrado. para Otras proteínas fusionadas a NT Ref.30. Las proteínas de fusión His-NT-GFP (300 mg/ml) e His-NT-PNP (100 mg/ml) formaron geles después de 2 horas y 6,5 horas a 37 °C y, lo que es más importante, la fracción de GFP permaneció sin cambios.observado después de la gelificación, quedando> 70% de la intensidad de fluorescencia inicial después de la gelificación (Fig. 6a).Para medir la actividad de PNP en soluciones y geles de his-NT-PNP, tuvimos que diluir la proteína de fusión con NT porque la actividad enzimática de la preparación pura estaba fuera del rango de detección del ensayo en concentraciones de gelificación.El gel formado con una mezcla que contenía 0,01 mg/ml de His-NT-PNP y 100 mg/ml de NT retuvo el 65% de la actividad enzimática inicial de las muestras preincubadas (Fig. 6b).El gel permaneció intacto durante la medición (Figura complementaria 10).
a Intensidad de fluorescencia relativa antes y después de la gelificación de His-NT-GFP (300 mg/ml) y vial invertido que contiene hidrogel de His-NT-GFP (300 mg/ml) bajo luz visible y UV.Los puntos muestran mediciones individuales (n = 3), las barras de error muestran la desviación estándar.El valor promedio se muestra en el centro de las barras de error.b La actividad de PNP se obtuvo mediante análisis fluorométrico utilizando soluciones y geles que consistían en NT (100 mg/ml) y una mezcla que contenía 0,01 mg/ml de his-NT-PNP y 100 mg/ml de nuevos dólares de Taiwán.El recuadro muestra un vial invertido que contiene un hidrogel que contiene His-NT-PNP (barra de escala de 5 mm).
Aquí, informamos la formación de hidrogeles a partir de NT y otras proteínas espidroína recombinantes mediante la incubación de una solución de proteína a 37 ° C (Figura 1).Mostramos que la gelificación está asociada con la transformación de hélices α en capas β y la formación de fibrillas similares a amiloide (Figs. 3 y 4).Este hallazgo es sorprendente ya que las NT son haces globulares enrollados de cinco hélices conocidos por su extremadamente alta solubilidad y alta estabilidad en concentraciones >200 mg/mL a 4°C durante varios días27.Además, las NT se repliegan fácilmente después de la desnaturalización por calor a bajas concentraciones de proteína en µM.Según nuestros resultados, la formación de fibrillas requiere una combinación de una concentración de proteína> 10 mg/ml y una temperatura ligeramente elevada (Fig. 1).Esto es consistente con la idea de que se pueden formar fibrillas de amiloide a partir de proteínas plegadas globulares que se encuentran en un estado parcialmente desplegado debido a fluctuaciones térmicas en condiciones fisiológicas 48 .Ejemplos de proteínas que sufren esta conversión incluyen la insulina49,50, la β2-microglobulina, la transtiretina y la lisozima51,52,53.Aunque NT es una hélice α en su estado nativo, aproximadamente el 65% de la cadena polipeptídica es compatible con la formación de cremallera estérica (Fig. 4e) 45.Dado que el monómero es dinámicamente móvil46, puede exponer estas regiones amiloidogénicas potenciales a temperaturas moderadamente elevadas y a altas concentraciones de proteína total puede alcanzar una concentración crítica para la formación de fibrillas de amiloide54.Siguiendo este razonamiento, encontramos una correlación negativa entre la concentración de espidroína y el tiempo de gelificación (Fig. 1c), y si la conformación monomérica NT se estabiliza mediante mutaciones (NT*, His-NT-L6) o mediante la adición de sal, se puede prevenir la formación de hidrogeles (Fig. 5).
En la mayoría de los casos, las fibrillas de amiloide desaparecen de la solución en forma de precipitado, pero bajo ciertas condiciones pueden formar hidrogeles55,56,57.Las fibrillas formadoras de hidrogel suelen tener una relación de aspecto alta y forman redes tridimensionales estables mediante entrelazamiento molecular,55,58 en consonancia con nuestros resultados.Para la formación de hidrogeles in vitro, las proteínas a menudo se desdoblan total o parcialmente, por ejemplo, mediante exposición a disolventes orgánicos, altas temperaturas (70 a 90 °C) y/o pH bajo (1,5 a 3,0)59,60,61,62.Los hidrogeles de espidroína descritos aquí no requieren un procesamiento severo ni agentes reticulantes para estabilizar los hidrogeles.
Anteriormente se informó que las repeticiones de espidroína y los QD, que parecen sufrir un cambio de lámina β durante el hilado de la seda, forman hidrogeles.En comparación con nuestros hallazgos, los tiempos de incubación y/o las temperaturas de incubación fueron significativamente más largos o más altos, respectivamente, y los hidrogeles resultantes fueron a menudo opacos (Figura 7 y Tabla complementaria 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Además de los tiempos de gel rápidos, los hidrogeles NT >300 mg/ml (30 %) superaron a todos los demás hidrogeles de proteína de seda de araña recombinantes descritos, así como a los hidrogeles naturales como gelatina, alginato (2 %), agar (0,5 % ) y colágeno.(0,6%) (Figura 7 y Tablas complementarias 1 y 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
El tiempo de gel y el módulo elástico de los hidrogeles en este estudio se compararon con otros hidrogeles a base de espidroína y con hidrogeles naturales seleccionados.Se dan referencias junto con una descripción de las condiciones de gelificación.APS Persulfato de amonio, temperatura ambiente.Datos 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Las arañas parecen haber desarrollado formas de evitar que la espidroína se gelifique durante el almacenamiento.A pesar de la alta concentración de proteína en la glándula de seda, la gran región repetida asociada con el dominio terminal significa que la concentración aparente de NT y CT en la glándula corresponde a aproximadamente 10-20 mg/ml, en el límite de este estudio.requerido para la formación de hidrogel observada in vitro.Además, concentraciones similares de sales 16 estabilizaron la NT, como en las glándulas de seda (Fig. 5b).Se ha estudiado la conformación de NT en el citosol de E. coli y se ha descubierto que está más plegada que cuando se examina in vitro, lo que indica además que la sal u otros factores impiden su agregación in vivo.Sin embargo, la capacidad de las NT para transformarse en fibrillas de lámina β puede ser importante para la formación de filamentos y debe investigarse en estudios futuros.
Además de los aspectos novedosos de la formación de hidrogel y fibrillas similares a NT-amiloide observados en este estudio, también mostramos que este fenómeno puede tener aplicaciones biotecnológicas y biomédicas (Fig. 8).Como prueba de concepto, combinamos NT con GFP o PNP y demostramos que la proteína de fusión también forma hidrogeles cuando se incuba a 37 °C y que las fracciones GFP y PNP conservan en gran medida su actividad después de la gelificación (Figura 6).Las nucleósidos fosforilasas son catalizadores importantes para la síntesis de análogos de nucleósidos75, lo que hace que nuestro descubrimiento sea relevante para la industria biofarmacéutica.El concepto de expresar proteínas de fusión que forman hidrogeles transparentes en condiciones favorables permite la creación de hidrogeles funcionalizados con propiedades favorables para una amplia gama de aplicaciones como la inmovilización de enzimas, la liberación controlada de fármacos y la ingeniería de tejidos.Además, NT y NT* son marcadores de expresión eficientes30, lo que significa que NT y sus variantes pueden usarse para la producción de alto rendimiento de proteínas de fusión solubles y la posterior creación de proteínas diana inmovilizadas en hidrogeles 3D.
NT es soluble, α-helicoidal y estable a bajas concentraciones (μM) y 37°C.A la misma temperatura, pero en concentraciones crecientes (>10 mg/ml), la NT forma geles que consisten en fibrillas similares a amiloide.Las proteínas de fusión NT también forman geles fibrilares con fragmentos de fusión completamente funcionales, lo que permite inmovilizar varias proteínas en hidrogeles 3D utilizando NT.Abajo: NT (PDB: 4FBS) e ilustraciones de redes de fibras y estructuras proteicas asociadas (supuestas y no dibujadas a escala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Las construcciones (consulte la Tabla complementaria 4 para obtener una lista completa que incluye secuencias de aminoácidos) se clonaron en el plásmido pT7 y se transformaron en E. coli BL21 (DE3).Se inocularon E. coli que contenían plásmidos modificados genéticamente en caldo Luria suplementado con kanamicina (70 mg/l) y se cultivaron durante la noche a 30°C y 250 rpm.Luego se inoculó el cultivo 1/100 en medio LB que contenía kanamicina y se cultivó a 30ºC y 110 rpm hasta que la DO600 alcanzó 0,8.Para los estudios de RMN, las bacterias se cultivaron en medio mínimo M9 que contenía 2 g de D-glucosa 13C (Aldrich) y 1 g de cloruro de amonio 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) para el marcaje de proteínas con isótopos.Baje la temperatura a 20 grados Celsius e induzca la expresión de proteínas con isopropiltiogalactopiranósido 0,15 mM (concentración final).Después de la expresión de proteínas durante la noche, las células se recogieron a 7278 xg, 4 °C durante 20 min.Los sedimentos celulares se resuspendieron en Tris-HCl 20 mM, pH 8, y se congelaron hasta su uso posterior.Las células descongeladas se lisaron utilizando un disruptor celular (máquinas de la serie TS, Constant Systems Limited, Inglaterra) a 30 kPa.Luego los lisados ​​se centrifugaron a 25.000 g durante 30 minutos a 4°C.Para NTMiSp, el sedimento se resuspendió luego en urea 2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8, y se sonicó durante 2 min (2 s encendido/apagado, 65%), luego se centrifugó nuevamente a 25.000 xg, 4°C dentro de 30 minutos.El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA, se lavó con Tris-HCl 20 mM, imidazol 2 mM, pH 8, y finalmente la proteína se eluyó con Tris-HCl 20 mM, imidazol 200 mM, pH 8. Para generar NT2RepCT y NTCT, la digestión con trombina introduce el sitio (ThrCleav) entre His y NT.Los sitios de escisión de trombina también están presentes en His-NT-ThrCleav-2Rep (produce 2Rep), His-tioredoxina-ThrCleav-NT (produce NT), His-tioredoxina-ThrCleav-CT (produce CT), His-Tiorredoxina-ThrCleav-NT .* (produce NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produce NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produce NTF1Sp) y His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produce NTMiSp).Las construcciones se digirieron con trombina (1:1000) y se dializaron durante la noche a 4 ºC con Tris-HCl 20 mM, pH 8, usando una membrana de diálisis Spectra/Por con un umbral de peso molecular de 6-8 kDa.Después de la diálisis, la solución se carga en una columna de Ni-NTA y se recoge el efluente que contiene la proteína de interés.Las concentraciones de proteínas se determinaron midiendo la absorbancia UV a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción de cada proteína, excepto para NTF1Sp, que utilizó el ensayo de Bradford según el protocolo del fabricante.La pureza se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (4–20%) y tinción con azul brillante de Coomassie.Las proteínas se concentraron utilizando filtros centrífugos (VivaSpin 20, GE Healthcare) a 4000 xg con un límite de peso molecular de 10 kDa en ciclos de 20 minutos.
Descongele la solución de proteínas y pipetee con cuidado 150 µl en un vial con tabique transparente de 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Los tubos se taparon y sellaron con parafilm para evitar la evaporación.Las muestras (n = 3) se incubaron a 37 °C o 60 °C y se invirtieron periódicamente para observar la gelificación.Las muestras que no gelificaron se incubaron durante al menos una semana.Reducir los enlaces disulfuro NTMiSp con 10 mM de DTT por proteína de 10 mM.Para analizar la gelificación de los recubrimientos naturales de seda de araña, se cortó la araña puente sueca, las dos glándulas ampolladas principales se colocaron en 200 µl de tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8, y se cortaron para permitir que el recubrimiento se separara de las glándulas..El contenido de las glándulas se disuelve en tampón, 50 µl para determinación del peso seco (mediante incubación de viales abiertos a 60 °C hasta peso constante) y 150 µl para gelificación a 37 °C.
La geometría/herramienta de medición está hecha de acero inoxidable mediante una placa paralela con un diámetro superior de 20 mm y una separación de 0,5 mm.Calentar la muestra de 25 °C a 45 °C y nuevamente a 25 °C a una velocidad de 1 °C por minuto utilizando una placa Peltier con fondo de acero inoxidable.Las mediciones vibratorias se llevaron a cabo a una frecuencia de 0,1 Hz y en la región viscoelástica lineal del material con una deformación del 5% y 0,5% para muestras de 100 mg/mL y 300-500 mg/mL, respectivamente.Utilice una cámara de humedad personalizada para evitar la evaporación.Los datos se analizaron utilizando Prism 9.
Para recolectar espectros infrarrojos (IR) a temperatura ambiente de 800 a 3900 cm–1.El dispositivo ATR, así como el paso de la luz a través del espectrómetro, se purgan con aire filtrado seco antes y durante el experimento.Se pipetearon soluciones (500 mg/ml para minimizar los picos de absorción de agua en los espectros) sobre los cristales y se formaron geles (500 mg/ml) antes de la medición y luego se transfirieron a los cristales (n = 3).Se registraron 1000 escaneos con una resolución de 2 cm-1 y un ciclo de trabajo cero de 2. La segunda derivada se calculó usando OPUS (Bruker) usando un rango de suavizado de nueve puntos.Los espectros se normalizaron a la misma región de integración entre 1720 y 1580 cm-1 utilizando el “Spectragryph – Optical Spectroscope Software” de F. Menges.En la espectroscopia ATR-IR, la profundidad de penetración de un haz infrarrojo en una muestra depende del número de onda, lo que da como resultado una absorción más fuerte con números de onda más bajos que con números de onda más altos.Estos efectos no se han corregido para los espectros mostrados en las Figs.3 porque son muy pequeños (Figura complementaria 4).Los espectros corregidos para esta figura se calcularon utilizando el software Bruker OPUS.
En principio, es posible una cuantificación completa de las conformaciones de proteínas después de una deconvolución confiable de los componentes dentro del pico de amida I.Sin embargo, en la práctica surgen algunos obstáculos.El ruido en el espectro puede aparecer como picos (falsos) durante la deconvolución.Además, el pico debido a la flexión del agua coincide con la posición del pico de amida I y puede tener una magnitud similar para muestras que contienen una gran cantidad de agua, como el gel acuoso estudiado aquí.Por lo tanto, no intentamos descomponer completamente el pico de amida I y nuestras observaciones solo deben considerarse como apoyo a otros métodos como la espectroscopia de RMN.
Se gelificaron soluciones de 50 mg/ml de NT y His-NT2RepCT durante la noche a 37°C.Luego se diluyó el hidrogel con Tris-HCl 20 mM (pH 8) hasta una concentración de 12,5 mg/ml, se agitó bien y se pipeteó para romper el gel.A continuación, el hidrogel se diluyó 10 veces con Tris-HCl 20 mM (pH 8), se aplicaron 5 μl de la muestra a una rejilla de cobre recubierta con formvar y el exceso de muestra se eliminó con papel secante.Las muestras se lavaron dos veces con 5 µl de agua MilliQ y se tiñeron con formiato de uranilo al 1% durante 5 minutos.Retire el exceso de tinte con papel absorbente y luego seque la malla al aire.Las imágenes se realizaron en estas rejillas utilizando un FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN que funciona a 100 kV.Las imágenes se grabaron con aumentos de x 26.500 y x 43.000 utilizando una cámara CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemania).Para cada muestra (n = 1), se registraron entre 10 y 15 imágenes.Se utilizó ImageJ (https://imagej.nih.gov/) para el análisis de imágenes y la medición de los diámetros de las fibras (n = 100, diferentes fibras).Se utilizó Prism 9 para realizar pruebas t no apareadas (de dos colas).Las fibrillas medias de His-NT2RepCT y NT fueron 11,43 (DE 2,035) y 7,67 (DE 1,389) nm, respectivamente.El intervalo de confianza (95%) es de -4,246 a -3,275.grados de libertad = 198, p < 0,0001.
Se midieron 80 µl de muestras líquidas que contenían tioflavina T (ThT) 10 µM por triplicado (n = 3) en condiciones estáticas utilizando placas Corning de 96 pocillos con fondo negro y fondo transparente (Corning Glass 3881, EE. UU.).Las diferencias de fluorescencia se registraron utilizando un filtro de excitación de 440 nm y un filtro de emisión de 480 nm (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenburg, Alemania).La señal de ThT no se saturó ni se extinguió, ya que se realizaron experimentos con diferentes concentraciones de ThT sin cambiar la intensidad de la señal.Registre la absorbancia a 360 nm para medir la turbidez.Para los experimentos de siembra, se formaron geles de 100 mg/ml a 37 °C, se resuspendieron y se usaron para la siembra en proporciones molares del 5 %, 10 % y 20 %.Los datos se analizaron utilizando Prism 9.
Descongelar las existencias de His-NT2RepCT y NT >100 mg/ml en hielo y filtrar a través de un filtro de 0,22 m.Las concentraciones se calcularon midiendo la absorbancia a 280 nm usando Nanodrop.En pocillos de una placa negra no vinculante de 96 pocillos (Corning) con fondo transparente, las muestras se diluyeron a 20 mg/ml en Tris-HCl 20 mM, pH 8 y se mezclaron con ThT 5 μM (concentración final), concentración total de la muestra. 50 µl de volumen.Se tomaron imágenes de las muestras cada 10 minutos a 37 ° C en un microscopio CellObserver (Zeiss) con canal de luz transmitida y conjuntos de filtros de emisión y excitación FITC para imágenes ThT.Se utiliza una lente de 20x/0,4 para obtener imágenes.Se utilizaron Zen Blue (Zeiss) e ImageJ (https://imagej.nih.gov/) para el análisis de imágenes.También se prepararon geles a partir de soluciones de NT e His-NT2RepCT a una concentración de 50 mg/ml que contenían Tris 20 mM, pH 8 y ThT 5 µM, y se incubaron a 37 °C durante 90 min.Los trozos de gel se transfirieron a un pocillo nuevo que contenía Tris 20 mM, pH 8 y ThT 5 μM en una placa de fondo transparente de 96 pocillos negra sin unión.Adquiera imágenes de fluorescencia verde y campo brillante con un aumento de 20x/0,4.ImageJ se utilizó para el análisis de imágenes.
Los espectros de RMN en solución se obtuvieron a 310 K en un espectrómetro Bruker Avance Neo de 600 MHz equipado con una criosonda de campo de gradiente pulsado de resonancia cuadrupolo QCI (HFCN).Muestras de RMN que contienen 10 mg/ml de proteína homogénea marcada con 13C, 15N, disuelta en Tris-HCl 20 mM (pH 8), 0,02 % (p/v) de NaN3, 5 % de DO (v/v), (n = 1) .Se utilizaron cambios químicos de NT2RepCT a pH 6,7 para asignar el pico 23 en el espectro 2D de 15N-HSQC.
Los espectros de RMN sólida (MAS) de giro en ángulo mágico de hidrogeles marcados con 13C y 15N se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III HD a 800 MHz equipado con una sonda sin electrones de 13C/15N{1H} de 3,2 mm.La temperatura de la muestra se controló utilizando una corriente de gas de temperatura variable a 277 K. Se adquirieron espectros de resonancia rotacional dipolo bidimensional (DARR)76 y reconexión de radiofrecuencia (RFDR)77 a frecuencias MAS de 12,5 kHz y 20 kHz, respectivamente.La polarización cruzada (CP) de 1H a 13C se realizó utilizando una rampa lineal de 60,0 a 48,0 kHz a 1H, 61,3/71,6 kHz a 13C (a 12,5/20 kHz MAS) y un tiempo de contacto de 0,5 a 1 ms.Durante la recopilación de datos se utilizó el desacoplamiento Spinal6478 a 73,5 kHz.El tiempo de adquisición fue de 10 milisegundos y el retraso del ciclo fue de 2,5 segundos.Las correlaciones Cα/Cβ de enlace simple observadas en los espectros RFDR se asignaron en función de los cambios químicos característicos del tipo de residuo y las correlaciones de enlace múltiple en los espectros DARR.
Se utilizó la base de datos Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) para evaluar las tendencias de aleteo y la energía de Rosetta para NT, NTFlSp y NTMiSp.La base de datos de Zipper calcula Rosetta Energy80, que combina varias funciones de energía libre para modelar y analizar la estructura de las proteínas.Un nivel de energía de -23 kcal/mol o menos indica una alta tendencia a fibrilar.La menor energía significa más estabilidad de las dos hebras β en la conformación de la cremallera.Además, se utilizó el algoritmo Waltz para predecir regiones amiloidogénicas en NT, NTFlSp y NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
La solución de proteína NT se mezcló con tampón de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) a pH 5,5 y 6,0 para reducir el pH a 6 y 7, respectivamente.La concentración final de proteína fue de 100 mg/ml.
Las mediciones se realizaron en un espectrómetro J-1500 CD (JASCO, EE. UU.) utilizando una cubeta de 300 μL con un camino óptico de 0,1 cm.Las proteínas se diluyeron a 10 µM (n = 1) en tampón fosfato 20 mM (pH 8).Para analizar la estabilidad de las proteínas en presencia de sal, las proteínas se analizaron a la misma concentración (n = 1) en tampón fosfato 20 mM (pH 8) que contenía NaF o NaCl 154 mM, respectivamente.Los escaneos de temperatura se registraron a 222 nm desde 25 °C a 95 °C con una velocidad de calentamiento de 1 °C/min.La proporción de proteínas plegadas de forma nativa se calculó utilizando la fórmula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Además, se registraron cinco espectros para cada muestra desde 260 nm a 190 nm a 25°C y después de calentar a 95°C.Se promediaron, suavizaron y convirtieron cinco espectros a elipticidad molar.Los datos se analizaron utilizando Prism 9.
La intensidad de fluorescencia de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) se midió por triplicado (n = 3) en placas Corning de 96 pocillos con fondo negro transparente (Corning Glass 3881, EE. UU.) en condiciones estáticas.Mida las muestras con un lector de placas basado en fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 395 nm y registre la emisión a 509 nm antes de la gelificación y 2 horas después a 37 °C.Los datos se analizaron con Prism 9.
Se utilizó un kit de ensayo de actividad de purina nucleósido fosforilasa (método fluorométrico, Sigma Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Para medir la actividad en geles y soluciones que contienen His-NT-PNP, mezcle 10 ng de His-NT-PNP con 100 mg/mL de NT hasta un volumen total de 2 l porque el gel dio una señal por encima del intervalo de detección del conjunto.Se incluyeron controles para geles y soluciones sin His-NT-PNP.Las mediciones se realizaron dos veces (n = 2).Después de medir la actividad, se eliminó la mezcla de reacción y se fotografió el gel para garantizar que el gel permaneciera intacto durante la medición.Los datos se analizaron utilizando Prism 9.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del estudio de Nature vinculado a este artículo.
Las figuras 1 y 2 presentan los datos iniciales.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f y 6, figuras complementarias.3, fig. complementaria.5a, d, fig. complementaria.6 y fig. complementaria.8. Datos Los datos de este estudio están alojados en la base de datos Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Los datos de RMN obtenidos en este estudio se publicaron en el repositorio de BMRBig con el ID de entrada bmrbig36.Las estructuras de GFP y PNP se tomaron de PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. y Johansson, J. Hilado de seda de araña artificial.Química Nacional.biología.11, 309–315 (2015).
Babb, PL y cols.El genoma de Nephila clavipes destaca la diversidad de genes de la seda de araña y su compleja expresión.Genette Nacional.49, 895–903 (2017).