Componente químico de tubo flexible de acero inoxidable 347, Identificación de nuevas proteínas chaperonas del antígeno leucocitario humano A (HLA-A) sensibles al interferón mediante espectrometría de masas reticulada (CLMS)

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Descripción del Producto

Tubos en espiral de acero inoxidable 347L, grado de acero: SS347L

El sistema de señalización del interferón induce una fuerte respuesta de citocinas a una amplia gama de señales patógenas y patológicas intrínsecas del medio ambiente, lo que da como resultado la inducción de subconjuntos de proteínas inducibles por el interferón.Aplicamos espectrometría de masas de enlace cruzado (CLMS) mediada por DSS para detectar nuevas interacciones proteína-proteína en el dominio de las proteínas inducidas por interferón.Además de las proteínas inducibles por interferón esperadas, también identificamos nuevos aductos reticulados intermoleculares e intramoleculares de proteínas canónicas inducibles por interferón como MX1, USP18, OAS3 y STAT1.Nos centramos en la validación ortogonal de un nuevo conjunto de redes de proteínas inducibles por interferón formadas por proteínas HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) mediante co-inmunoprecipitación y su estudio posterior mediante modelado de dinámica molecular.El modelado de la dinámica conformacional del complejo proteico reveló varios sitios de interacción que reflejaban las interacciones identificadas en los hallazgos del CLMS.Juntos, presentamos un estudio piloto de CLMS para identificar nuevos complejos de señalización inducidos por interferón y esperamos un uso más amplio de CLMS para identificar nuevas dinámicas de interacciones de proteínas en el microambiente tumoral.
Antes de que comience una respuesta inmune adaptativa, el sistema de defensa innato del huésped genera una respuesta antimicrobiana mediada por una familia de citoquinas alfa-helicoidales secretadas llamadas interferones (IFN).Las clases de IFN tipo I, IFNα e IFNβ, activan respuestas celulares, incluidos estados antivirales, proapoptóticos, proinflamatorios y antiproliferativos.En humanos, se conocen 13 subtipos de IFNα, todos agrupados en el cromosoma 91. Sorprendentemente, sólo se ha estudiado el IFNα2 para uso clínico.Recientemente se ha prestado especial atención a la investigación de otros subtipos de IFNα.Un estudio reciente demostró que el IFNα14 es una de las isoformas más efectivas para restringir la replicación del VHB2 y el VIH-13,4 en comparación con el subtipo canónico de IFNα2.
Se ha establecido que los complejos receptores de interferón tipo I activados (IFNAR1 e IFNAR2) desencadenan una cascada de transducción de señales mediada por las Janus quinasas TYK2 y JAK15,6.Estas Janus quinasas fosforilan transductores de señal y activadores de proteínas transcripcionales (STAT1 y STAT2) en residuos de tirosina para iniciar la heterodimerización mediada por el dominio SH26.Posteriormente, IRF9 se une a los heterodímeros STAT para formar un complejo trimérico del gen del factor 3 estimulado por IFN (ISGF3), que se transloca al núcleo e induce la transcripción de más de 2000 genes estimulados por interferón (ISG)5,6,7,8.
Los ISG forman la columna vertebral del sistema inmunológico innato, especialmente en respuesta al ataque viral.Como primera línea de defensa contra la infección viral, las células despliegan rápidamente amplias interacciones de proteínas celulares con una amplia gama de actividades biológicas.Estas proteínas incluyen receptores de reconocimiento de patrones, moléculas de señalización, factores de transcripción y proteínas con funciones antivirales directas, así como reguladores negativos de las respuestas inmunes9.Gran parte de la información sobre la actividad de ISG proviene de exámenes funcionales que utilizan exámenes de sobreexpresión10,11 o técnicas de silenciamiento de genes (siRNA, RNAi y CRISPR)12,13 en las que los ISG individuales se expresan o inhiben y su actividad se prueba en varios virus.Aunque estos estudios han determinado las propiedades antivirales de los ISG individuales, los mecanismos moleculares subyacentes de cada ISG siguen siendo en gran medida desconocidos.Generalmente se acepta que muchas proteínas interactúan con una o más citoquinas para asegurar una actividad completa, por lo que los ISG interactúan directamente o sus interacciones están mediadas por proteínas celulares.Por ejemplo, un estudio reciente de proteómica fotoentrecruzada identificó a la ATPasa VCP/p97 como un importante socio de interacción de IFITM3, cuya inhibición conduce a defectos en la clasificación lisosomal, el recambio y el cotransporte de IFITM3 con partículas virales 14 .Mediante inmunoprecipitación, identificamos a VAPA, una proteína asociada a vesículas, como un compañero de interacción con IFITM1/2/3 que media la maduración viral mediada por el colesterol, y esto fue confirmado por otro estudio que utilizó un sistema de dos híbridos de levadura.Apoyo científico 15 , 16 .
Un proceso biológico fundamental implicado en la supresión de la infección y la transformación maligna es la presentación de antígenos, que está mediada por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).Los péptidos (de 8 a 12 aminoácidos de longitud) de proteínas escindidas, terminadas prematuramente o mal plegadas se cargan en el heterodímero del MHC-I (que consta de cadenas pesadas y ligeras del MHC-I, llamado β-2-microglobulina; β2M) 17,18.Los trímeros MHC-I estables resultantes se transportan a la superficie celular, donde presentan péptidos intracelulares a las células T CD8+ (células T citotóxicas)17.Las células T reconocen y destruyen estos patógenos y las células que portan un antígeno específico del tumor.En consecuencia, los patógenos y las células tumorales suelen suprimir el proceso de presentación de antígenos para evitar la vigilancia inmunitaria.Además, el MHC-I está regulado negativamente en el 40-90% de los tumores humanos y a menudo se asocia con un peor pronóstico19.
Los genes implicados en la respuesta a los patógenos deben cambiar rápidamente entre un estado de reposo y un estado de transcripción activa.Por lo tanto, se supone que varias proteínas celulares participan en la respuesta a una alta demanda de IFN durante períodos cortos de tiempo, incluida la remodelación y modificación de la cromatina promotora 20,21.La mayoría de los estudios se han centrado en la identificación de proteínas asociadas ISG individuales en presencia de IFN.Varios estudios proteómicos y transcriptómicos en sistemas celulares modelo han dilucidado el efecto del IFN en el paisaje celular.Sin embargo, a pesar de una comprensión cada vez mayor de la dinámica inducida por los interferones, todavía sabemos poco sobre la participación de los ISG.Al considerar la complejidad y la dinámica dependiente del tiempo de la señalización del interferón, surgen dos preguntas: (i) ¿es posible estabilizar y atrapar los complejos multiproteicos involucrados en la señalización rápida y (ii) se pueden mapear estas interacciones en el espacio 3D?
Para abordar estos problemas, implementamos el entrecruzamiento químico (DSS) mediado por suberato de disuccinimida junto con espectrometría de masas (CLMS) para estudiar la red de interacción de proteínas inducida por IFNα y su dinámica.DSS añade enlaces covalentes entre residuos proximales de proteínas y/o complejos proteicos in vivo.El análisis de EM posterior revela sitios de entrecruzamiento específicos que reflejan la proximidad espacial de regiones dentro de una proteína particular, llamados enlaces internos, o subunidades en complejos de proteínas, llamadas interrelaciones.Utilizando este enfoque, hemos identificado varios complejos proteína-proteína novedosos, así como redes de interacción multiproteica inducidas por interferón.Al probar más a fondo un subconjunto de estas nuevas interacciones, demostramos que H2BFS (FS de tipo histona H2B; en lo sucesivo denominado H2B) y MDN1 actúan como socios de unión para HLA-A.
Las células Flo-1 son uno de los modelos in vitro más conocidos de adenocarcinoma de esófago, ya que imitan características clave de los tumores de esófago22,23.Sin embargo, no todos los tumores son inmunogénicos y, para determinar si las células Flo-1 responden al tratamiento con interferón, tratamos las células Flo-1 con 10 ng/ml de IFNα durante 72 horas.Las células Flo-1 mostraron una inducción temprana de pSTAT1 e IRF1, comenzando 2 horas después del tratamiento y continuando durante 72 horas, con una disminución dependiente del tiempo en los niveles estacionarios de IRF1 (Figura 1A).Se encontró que los ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 e ISG15) estaban fuertemente inducidos después de 6 horas, imitando las respuestas clásicas de fase media y tardía al IFNα (Figura 1A).En conjunto, estos datos sugieren que este modelo celular puede usarse para estudiar las respuestas al interferón.
Respuestas diferenciales de expresión de proteínas en células Flo-1 después del tratamiento con IFNα.(A) La expresión de proteínas en células Flo-1 tratadas con 10 ng/ml de IFNα durante 2, 6, 24, 48 y 72 horas se analizó mediante inmunotransferencia utilizando los anticuerpos ISG indicados.(B) Geles SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie de extractos de células completas después de la reticulación con DSS durante los tiempos y concentraciones indicados.(C) Inmunotransferencia representativa examinada con anticuerpo p53(DO-1) de las mismas muestras para evaluar el grado de entrecruzamiento de proteínas.
Para capturar el panorama de interacción de proteínas in situ, utilizamos DSS, un agente de reticulación ampliamente utilizado debido a su alta permeabilidad de membrana y su tiempo de reacción relativamente corto.El tiempo de reacción más corto ayuda a prevenir la formación de grandes agregados de proteínas entrecruzadas, manteniendo así la estabilidad del reticulante.Para determinar la concentración óptima de DSS y evitar la reticulación excesiva, primero expusimos las células a DSS 5, 2,5 y 1 mM durante 5, 10, 5 y 30 minutos, respectivamente, y analizamos los lisados ​​mediante SDS-PAGE teñida con Coomassie. (datos no mostrados) .Los lisados ​​celulares parecen estar altamente entrecruzados en la concentración más baja y en el momento más corto.Por lo tanto, el DSS se tituló a 1, 0,5 y 0,1 mM durante 5 minutos (Figura 1B).Se observó una reticulación óptima con DSS 0,5 mM durante 5 minutos, y estas condiciones se eligieron para las células tratadas con IFNα.Además, la Figura 1C muestra una transferencia Western realizada utilizando el anticuerpo p53 (DO-1) para evaluar el grado de entrecruzamiento de proteínas.
Las células Flo-1 se trataron con 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas antes de añadir el reticulante.Posteriormente, las células entrecruzadas se lisaron mediante proteólisis en dos pasos y las proteínas se procesaron mediante FASP (Fig. 2)24,25.Los péptidos trípticos reticulados se analizaron mediante espectrometría de masas (Fig. 2).Luego, los espectros MS/MS se comparan con la secuencia de proteínas y se cuantifican con MaxQuant26,27.Los péptidos reticulados se identificaron a partir de los espectros obtenidos utilizando el programa SIM-XL, y los compuestos individuales se combinaron en una red compleja utilizando los canales de software informático de código abierto xQuest28 y SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identifica interacciones proteína-proteína, cadenas internas y cadenas individuales en mezclas de proteínas simples o complejas y proporciona guiones para visualizar interacciones en estructuras de proteínas.Además, clasifica cada referencia cruzada como una puntuación de identificación según la calidad del espectro MS/MS29.Se han identificado varias interacciones y complejos proteína-proteína altamente confiables, y se ha investigado más a fondo un nuevo conjunto de interacciones utilizando coinmunoprecipitación y cambios conformacionales de complejos utilizando modelos de dinámica molecular (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Descripción esquemática del método CLMS.Las células Flo-1 se trataron con 10 ng/ml de IFNα durante 24 horas seguido de entrecruzamiento de proteínas in situ usando DSS seguido de lisis celular y tripsinización.Las muestras reticuladas se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap y se tomaron muestras adicionales para detectar la fragmentación de los precursores de péptidos durante LC-MS/MS.Se identificaron dos péptidos enlazados a partir de los espectros obtenidos utilizando la máquina de reconocimiento de espectro del programa Crosslinked Peptides (SIM-XL), y todos los compuestos se combinaron en una red compleja mediante procesos computacionales.Filtre las interacciones de baja confianza según las puntuaciones de la tasa de falsos positivos (FDR).Se confirmaron además varias interacciones nuevas entre proteínas de alta fidelidad mediante coinmunoprecipitación, y se examinaron los cambios conformacionales en los complejos mediante modelos de dinámica molecular (MD).
Se detectaron un total de ~ 30 500 y ~ 28 500 péptidos utilizando MaxQuant en muestras de IFNα estimuladas y no estimuladas, respectivamente (Tabla complementaria S1, Fig. 3A).La distribución de la longitud de los péptidos en ambos casos mostró una mayor proporción de péptidos más grandes, lo que indica la presencia de péptidos entrecruzados (Fig. 3B, C).Además, una mayor proporción de péptidos más grandes estuvo presente en el rango de 40 a 55 en las muestras tratadas con IFNα (Fig. 3C).El mapeo de proteínas contra la intensidad log2 mostró que las proteínas clásicas estimuladas por interferón eran las más abundantes en comparación con las muestras no tratadas, incluidas MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 y HLA-F (Figura 3D).El análisis de las vías para proteínas enriquecidas más de tres veces en respuesta al tratamiento con IFNα utilizando la base de datos de vías Reactome mostró que la presentación y el procesamiento del antígeno mediado por MHC-I era la vía más dominante (Figura 3E).De acuerdo con informes anteriores, las respuestas antivirales mediadas por OAS e ISG15, así como IFNα/β y la señalización de citoquinas, se encontraban entre las vías activadas.Además, se identificaron entrecruzamientos de proteínas específicas de lisina y serina a partir de los espectros MS/MS adquiridos originalmente utilizando SIM-XL.Un estudio reciente informó 104 ISG que abarcan 20 virus de 9 clases de virus mediante un metanálisis de estudios de sobreexpresión de ISG individuales en 5 tipos de células9.Sin embargo, para superar las limitaciones computacionales de la detección de grandes conjuntos de datos, comenzamos con un conjunto de datos más pequeño para explorar posibles interacciones entre la lista de genes IRDS informada por Padaria et al., la mayoría de los cuales son ISG.
Identificación de proteínas entrecruzadas expresadas diferencialmente en respuesta a IFNα (datos obtenidos de MaxQuant).(A) Diagrama de Venn que representa el número de péptidos comunes y exclusivos identificados en muestras de Flo-1 tratadas y no tratadas con IFNα14.Distribución de longitud de péptidos de muestras reticuladas no tratadas (B) y tratadas con IFNα (C).(D) Mapa de calor que representa log2 (intensidad de LFQ) entre células Flo-1 no tratadas y tratadas con IFNα14.El panel izquierdo muestra las proteínas activadas más activamente en presencia de IFNα.(E) Histograma que representa las 20 vías principales de enriquecimiento después del tratamiento con IFNα.La base de datos de la vía Reactome analizó cambios de más de cuatro veces en las proteínas reguladas positivamente que responden a IFNα.
La estimulación ISG mediada por interferón está bien documentada, pero a nivel molecular no se comprende bien cómo estas proteínas culminan en una amplia gama de funciones biológicas.Investigamos las interacciones de proteínas con un alto grado de confianza entre ISG conocidos.Curiosamente, identificamos una red que incluye proteínas MX1, USP18, ROBO1, OAS3 y STAT1 que forman un gran complejo en respuesta al tratamiento con IFNα (Figura 4, Tabla S2) 32,33,34.Lo más importante es que estas interacciones se encontraron en todos los triplicados tratados con IFNα y no se encontraron en muestras no tratadas, lo que sugiere que se formaron específicamente en respuesta al tratamiento con IFNα.Se sabe que STAT1 regula transcripcionalmente la expresión de estos ISG, pero no se ha estudiado su interacción con los ISG a nivel proteico.La estructura cristalina de STAT1 mostró que su dominio helicoidal (CCD) no participa en la interacción con el ADN o los protómeros durante la formación de dímeros35.Estas α-hélices forman una estructura helicoidal que proporciona una superficie predominantemente hidrófila para que se produzcan interacciones 35 .En nuestros datos de CLMS, observamos que la mayoría de las interacciones con STAT1 ocurrieron en el dominio SH2 que precede al CCD, el dominio enlazador o la cola C-terminal (residuos 700-708) (Figura 4A).Un estudio anterior informó que USP18 se une al CCD y al dominio de unión al ADN (DBD) de STAT2 y se recluta en la subunidad del receptor de interferón tipo I IFNAR2 para mediar en la inhibición de la señalización del interferón tipo I 24.Nuestros datos también mostraron que el dominio catalítico USP18 interactúa con STAT1 DBD (Figura 4A,D), lo que sugiere que tanto STAT1 como STAT2 pueden desempeñar un papel en atraer USP18 a IFNAR2.
Red ISG proteína-proteína identificada en células entrecruzadas tratadas con IFNα.(A) Gráfico de interacción 2D que muestra interacciones proteína-proteína (generadas en el programa SIM-XL), con líneas que representan interacciones intermoleculares (corte de entrecruzamiento establecido en 3,5).Los dominios de diferentes identidades están marcados por su color32: dominio MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) y GED (569–660).Dominios OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) y OAS1_C (903-108).Dominio ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) y nota 3 (777–864).Campos STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) y STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Visor circular de proteínas entrecruzadas (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 y STAT1) con interacciones e interacciones marcadas en azul y rojo, respectivamente.El umbral de reticulación se fijó en 3,5.Los gráficos de puntos indican los sitios de interacción de STAT1 con MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) y OAS3 (F), así como los sitios de interacción K o S entre los dos péptidos.En la figura, el umbral de puntuación de entrecruzamiento se establece en 3,0.(G) Varios sitios de interacción entre los dominios DI STAT1 y OAS3 superpuestos a sus estructuras proteicas en PyMol (sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (identificación de pdb: 1bf533) y OAS3 (identificación de pdb: 4s3n34).) programa.
Se han descrito dos isoformas de USP18 en humanos, una proteína de longitud completa que se localiza predominantemente en el núcleo, y una isoforma sin dominio N-terminal, USP18-sf, que se distribuye uniformemente en el citoplasma y el núcleo 36 .Además, se predijo que el extremo N no estaba estructurado y no requería actividad isopeptidasa ni unión a ISG1537.La mayoría de las interacciones identificadas en nuestro estudio se ubicaron en el extremo N de la proteína, lo que sugiere que estas interacciones involucran a USP18 de longitud completa (Figura 4A, D) y, por lo tanto, probablemente ocurren en el núcleo.Además, nuestros datos también indican que el extremo N está especializado en interacciones proteína a proteína.El sitio de unión de IFNAR2 se encuentra entre los residuos 312-368 y, en particular, ninguna de las proteínas del complejo se une a esta región (Fig. 4A) 37,38.Estos datos tomados en conjunto indican que el dominio de unión a IFNAR2 es utilizado exclusivamente por la proteína receptora.Además, solo se encontró que OAS3 y ROBO1 estaban asociados con dominios aguas arriba del extremo N y del sitio de unión de IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 pertenece a la superfamilia de moléculas de señalización transmembrana de inmunoglobulinas (Ig) y consta de cinco dominios de Ig y tres dominios de fibronectina (Fn) en la región extracelular.Estos dominios extracelulares están seguidos por una región proximal a la membrana y una única hélice transmembrana 39. Una región intracelular no estructurada está ubicada en el extremo C y contiene motivos de secuencia conservados que median la unión de la proteína efectora39.La región que se extiende desde los aminoácidos ~1100 a 1600 está mayoritariamente desordenada.Descubrimos que MX1 interactúa con ROBO1 a través de Ig, Fn y dominios intracelulares, mientras que la mayoría de las interacciones con STAT1 ocurren entre su CCD, dominio enlazador y el extremo C de ROBO1 (Fig. 4A, E).Por otro lado, las interacciones con las regiones enlazadoras DI, DIII y OAS3 se distribuyeron en toda la proteína ROBO1 (Fig. 4A).
La familia de proteínas oligoadenilato sintasa (OAS) acepta y se une al ARN bicatenario (dsRNA) intracelular, sufre cambios conformacionales y sintetiza oligoadenilatos unidos en 2',5' (2-5 As) 40 .Se descubrió que entre los tres OAS, OAS3 exhibe la mayor afinidad por el dsRNA y sintetiza la menor cantidad de 2 a 5 As, que pueden activar la RNasa L y, por lo tanto, limitar la replicación viral 41.La familia OAS consta de dominios de nucleótido transferasa similares a la polimerasa beta (pol-β).Investigaciones anteriores han demostrado que la actividad catalítica del dominio C-terminal (DIII) depende del dominio de unión a dsRNA (DI), que es necesario para la activación de OAS342.Observamos que los dominios DI y DII de OAS3 interactúan con CCD y una pequeña región de unión entre SH2 y STAT1 TAD (Figura 4A,F).La superposición de diferentes sitios de entrecruzamiento en la estructura de la proteína reveló una interacción entre la hoja β y el bucle DBD STAT1 y un bolsillo o cavidad abierta formada por los residuos 60 a 75 en el dominio DI de OAS3 (Fig. 4G).La orientación de las proteínas en el complejo también indicó que ninguna de las interacciones con OAS3 interfirió con la capacidad de unión al ADN de su dominio DI (Fig. S1A).Además, el dominio N-terminal de GTPasa MX1 interactúa ampliamente con los dominios DI y DIII de OAS3 (Fig. 4A).También observamos una interacción entre OAS1 y MX1 en las tres repeticiones tratadas con IFNα, donde un único dominio OAS1 (también catalíticamente activo) interactuó con los tres dominios MX1 (Figura S2A, B).
Las proteínas MX son parte de una gran familia de GTPasas similares a la dineína que contienen un dominio GTPasa N-terminal que se une e hidroliza GTP, un dominio intermedio que media el autoensamblaje y una cremallera de leucina C-terminal que actúa como una GTPasa (LZ ).dominio dominio efector25,43.MX1 se une a subunidades de polimerasas virales para bloquear la transcripción del gen viral43.Un análisis de dos híbridos de levadura informado anteriormente mostró que el MX1 asociado a PIAS1 inhibe la activación del gen mediada por STAT1 al bloquear la actividad de unión al ADN y también tiene actividad ligasa SUMO E344,45.Aquí, demostramos que MX1 se une a STAT1 (Figura 4C, D); sin embargo, es necesario estudiar más a fondo cómo esta interacción afecta la activación del gen mediada por STAT1 en respuesta a IFNα.Además, también encontramos que MX1 interactuaba con IFIT3 y DDX60 en las tres repeticiones tratadas con IFNα (Fig. S2C).
DDX60 es una helicasa citoplasmática inducida por IFN que previamente se ha informado que desempeña un papel en la degradación del ARN viral independiente de RIG-I46.Interactúa con RIG-I y activa su señalización de una manera específica del ligando 46. DDX60 consta de un dominio de helicasa DEXD/H-Box y un dominio de helicasa C-terminal que se une al ARN y al ADN viral47.La mayoría de sus interacciones con MX1 e IFIT3 ocurren dentro de largas regiones N y C-terminales sin dominios o motivos canónicos (Fig. S2E, F).Sin embargo, MX1 también está asociado con el dominio de helicasa DEXD/H-Box (Fig. S2E).Las proteínas de la familia IFIT tienen copias en tándem de un motivo distintivo de hélice-vuelta-hélice llamado repetición tetrapeptídica (TPR).Se descubrió que IFIT3 es un modulador positivo de la señalización RIG-I y, por tanto, un componente del complejo MAVS.En conjunto, nuestros datos sugieren que IFIT3 y DDX60 interactúan principalmente en la región entre TPR 3-6 de IFIT3 y pueden desempeñar un papel en la señalización de RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Dado que la detección de todo el proteoma requiere un uso computacional intensivo, luego analizamos toda la base de datos humana UniProt para detectar la presencia de una de las repeticiones tratadas con IFNα.En esta réplica, encontramos varias redes de interacción altamente confiables para HLA-A.El análisis de las vías de proteínas identificadas mediante espectros de MS/MS mostró que el procesamiento y la presentación de antígenos basados ​​en MHC-I es la vía principal inducida por el interferón (Fig. 3D).Por lo tanto, nos centramos en estudiar las interacciones proteicas de las moléculas de MHC-I con un alto grado de confianza en todas las muestras entrecruzadas.HLA consta de dominios y cadenas ligeras α1, α2 y α3, y la microglobulina β2 (β2m) es una proteína chaperona constante49.Una vez ensamblado en el retículo endoplásmico, el HLA es inestable en ausencia de ligandos peptídicos50.El surco de unión de péptidos está formado por los dominios α1 y α2 altamente polimórficos y no estructurados en forma no peptídica y el dominio α351 relativamente menos polimórfico.En presencia de IFNα, detectamos dos complejos HLA-A: uno interactúa con HMGA1 y H2B (Figura 5, Tabla S3) y el otro interactúa con MDN1, LRCH4 y H2B (Figura 6).
IFNα induce una red de interacción HLA-A con H2B (H2BFS) y HMGA1.(A) Gráfico 2D (generado en el software SIM-XL) que representa diferentes tipos de interacciones en el complejo H2B-HLA-A-HMGA1: interenlace (azul), interenlace (rojo) y enlace único (negro)..Los dominios de diferentes identidades están codificados por colores32: H2B (histona; 2–102) y MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 y MHC_I_C; 337–364).El umbral de reticulación se fijó en 3,5.Los gráficos de puntos indican los sitios de interacción de HLA-A con H2B (B) y HMGA1 (C), así como los sitios de interacción K o S entre los dos péptidos.En la figura, el umbral de puntuación de entrecruzamiento se establece en 3,0.(D) Relaciones entre proteínas mostradas en las estructuras de las proteínas H2B, HLA-A y HMGA1 en el programa PyMOL.Estas estructuras se modelaron utilizando el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) y las estructuras de plantilla para las proteínas H2B, HLA-A y HMGA1 fueron 1kx552, 1kj349 y 2eze55, respectivamente.
IFNα induce una red de interacción HLA-A con H2B (H2BFS), MDN1 y LRCH4.(A) Enlaces cruzados intramoleculares (rojo) e intermoleculares (azul) presentados en un mapa interactivo 2D (generado en el software SIM-XL) con MDN1 representado como un círculo.El umbral de reticulación se fijó en 3,5.Los dominios de diferentes identidades están codificados por colores32: H2B (histona; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupo C1; 210–290 y MHC_I_C; 337–364) y LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) y CH (535–641)).(B) Relaciones entre proteínas mostradas en las estructuras de las proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 y MDN1 en el programa PyMOL.Estas estructuras se modelaron utilizando el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) con las estructuras plantilla 1kx552, 1kj349, 6hlu62 y 6i2665 para las proteínas H2B, HLA-A, LRCH4 y MDN1. respectivamente.Gráficos de puntos que muestran los sitios de interacción K o S para HLA-A con H2B (C), LRCH4 (D) y MDN1 (E).Para las gráficas, el umbral de puntuación de enlace cruzado se estableció en 3,0.
Además de mantener la integridad del genoma, la histona H2B también participa en la regulación de la transcripción.La proteína H2B consta de un dominio de histona central (HFD) formado por tres hélices α separadas por bucles y una cola C-terminal 41,52.La mayor parte de la interacción con H2B ocurre en la hélice α1, que proporciona trimerización con el heterodímero HFD (Fig. 5A, B).Aunque las lisinas participan en la unión del ADN, algunas lisinas también son sitios alternativos de acetilación o metilación.Por ejemplo, los residuos K43, K46 y K57 de H2B no participan en la unión directa al ADN, pero son objetivos de diversas modificaciones postranscripcionales53.De manera similar, los residuos K44, K47 y K57 en H2B pueden desempeñar un papel alternativo en presencia de IFNα, incluidas las interacciones con otras proteínas (Fig. 5A, B).Además, la histona extracromosómica H2B activa la respuesta inmune en varios tipos de células, actuando como un sensor citosólico para detectar fragmentos de ADN bicatenario (ADNds) derivados de agentes infecciosos o células dañadas54.En presencia de virus de ADN, el agotamiento de H2B inhibió la producción de IFN-β y la fosforilación de STAT154.También se sabe que el H2B entra y sale del núcleo más rápido que otras histonas centrales54.También se observaron interacciones de H2B con MDN1 y LRCH4 en muestras seleccionadas no tratadas.Encontramos que HLA-A interactuaba con H2B en las tres muestras tratadas con IFNα y en una muestra repetida no tratada.Estos datos reflejan el papel del H2B en una función fisiológica alternativa independiente de la regulación transcripcional.
Se ha identificado HMGA1 (grupo de alta movilidad AT-Hook 1), una pequeña nucleoproteína rica en aminoácidos que promueven enfermedades, en asociación con HLA-A.Tiene una cola C-terminal ácida y tres DBD distintos llamados ganchos AT porque se unen al surco menor de la región rica en AT en el ADNds55,56.Esta unión hace que el ADN se doble o se enderece, permitiendo que los factores de transcripción canónicos accedan a su secuencia consenso.Se cree que la cola C-terminal está implicada en las interacciones proteína-proteína y en el reclutamiento de factores de transcripción, ya que los mutantes con deleción C-terminal no pueden iniciar la transcripción57.Además, este dominio contiene varios sitios de fosforilación conservados que son sustratos conocidos para las quinasas 58 .Observamos interacciones HLA-A y H2B con HMGA1 fuera del dominio C-terminal, lo que sugiere que el dominio C-terminal se usa principalmente para la unión del factor de transcripción (Fig. 5A, C).Las proteínas HMGA compiten con la histona H1 por unirse al ADN adaptador, aumentando así la accesibilidad57.De manera similar, parece probable que HMGA interactúe con la histona H2B a lo largo del ADN conector en competencia con la histona H1.HMGB1 induce la expresión de HLA-A, -B y -C en células dendríticas, lo que lleva a su activación59, pero no se ha informado previamente de una interacción entre HMG y HLA.Encontramos que HMGA1 interactúa con los dominios α1 y α3 de HLA-A, con la mayoría de las interacciones fuera de sus 3 DBD (Figura 5A, C).En nuestras manos, se encontró que HLA-A estaba localizado en el núcleo (datos no mostrados) y, dado que H2B y HMGA1 también están presentes en el núcleo, esta interacción probablemente ocurre en el núcleo.Los aductos específicos medidos entre H2B, HLA-A y HMGA1 se muestran en la Figura 5D.
La mayoría de las interacciones de HLA-A con otras proteínas ocurren dentro de sus dominios α1 y α2 y el dominio C-terminal desordenado (Fig. 6).En uno de estos ejemplos, encontramos que HLA-A interactúa con la cola N-terminal desordenada de LRCH4 (Figura 6A, D).LRCH4 regula la activación de TLR4 y la inducción de citoquinas LPS, modulando así la respuesta inmune innata60,61.Es una proteína de membrana con nueve repeticiones ricas en leucina (LRR) y un motivo de homología con calmodulina (CH) en su ectodominio, seguido de un dominio transmembrana (TMD) 60, 62.Se ha informado que los dominios CH median en las interacciones proteína-proteína 60 .Un tramo de aproximadamente 300 aminoácidos entre los dominios LRR y CH es relativamente accesible pero desordenado.Con base en la función de las regiones desordenadas como mediadores de las redes proteína-proteína y del transporte vesicular 63, encontramos que la mayoría de las interacciones entre proteínas ocurren en regiones desordenadas.Las interacciones con MDN1 se distribuyeron a lo largo de la proteína, incluidos los dominios LRR1, LRR6, CH y regiones aleatorias, mientras que H2B se unió principalmente al dominio CH (Fig. 6A, B).En particular, ninguna de las interacciones incluyó la ATM, lo que sugiere la especificidad del enfoque CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 también se ha identificado como parte de la red de proteínas HLA-A (Figura 6A).Pertenece a la familia de proteínas AAA (ATPasas asociadas a diferentes actividades).Este es el mismo dominio AAA N-terminal que se organiza en un anillo hexámero y elimina el factor de ensamblaje de la subunidad ribosómica 60S 64.parece ser similar a la dineína64,65,66.Además, a la región rica en Asp/Glu le sigue el dominio MIDAS (sitio dependiente de iones metálicos).Debido al gran tamaño de MDN1 (aproximadamente 5600 aminoácidos) y su homología limitada con proteínas bien estudiadas, se sabe poco sobre su estructura y función en humanos.Identificamos HLA-A, H2B y LRCH4 como socios de unión de MDN1 y revelamos su orientación como complejos de proteínas en PyMol (Fig. 6A, B).Estas tres proteínas interactúan con el dominio AAA, el dominio enlazador similar a dineína y posiblemente el dominio MIDAS MDN1.En un informe anterior, la purificación por afinidad de proteínas cebo identificó a MDN1 como una proteína asociada con la histona H2B67.Además, un estudio reciente también informó una interacción entre MDN y HLA-B en células HCT116 utilizando espectrometría de masas purificada por afinidad, lo que respalda nuestros hallazgos68.La identificación de este complejo en muestras tratadas con IFNα sugiere un papel de MDN1 en la señalización del interferón.
Debido a que los genes HLA son altamente polimórficos, extrajimos lecturas de secuenciación que mapean HLA-A, -B y -C de los datos de secuenciación de ARN de células Flo-1 (datos no mostrados).Las secuencias de péptidos consistentes con la lectura de secuenciación revelaron diferencias significativas entre HLA-A, -B y -C en regiones donde los péptidos entrecruzados se ubicaron en HLA-A (Figura S3).Además, no observamos entrecruzamiento de proteína a proteína de moléculas HLA-B/C con proteínas H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Esto sugiere que la interacción proteica encontrada entre HLA-A, MDN1, LRCH1 y HMGA1 es específica de HLA-A.Además, el análisis proteómico de muestras no reticuladas (Tabla S4) mostró que HLA-A tiene una mayor cobertura de secuencia en comparación con HLA-B o HLA-C.Los péptidos identificados para HLA-A fueron de alta intensidad tanto en las muestras tratadas con IFNα como en las no tratadas.
Para garantizar que las interacciones identificadas aquí no se debieran a un entrecruzamiento no específico de dos proteínas en estrecha proximidad espacial, confirmamos además dos nuevos factores de interacción HLA-A mediante la realización de ensayos de co-inmunoprecipitación.Se detectaron interacciones de HLA-A con MDN1 y H2B endógenos en células Flo-1 tanto tratadas con IFNα como sin tratar (Figura 7, Figura S4).Confirmamos que H2B capturó HLA-A en los inmunoprecipitados y que esta asociación se debió al tratamiento con IFNα, ya que HLA-A estaba ausente en las muestras de inmunoprecipitado de células no tratadas (Figura 7A).Sin embargo, nuestros datos sugieren que el IFNα regula diferencialmente la unión de HLA-A a H2B y MDN1.IFNα induce asociación entre H2B y HLA-A, pero reduce su asociación con MDN1.Encontramos que MDN1 estaba asociado con HLA-A en los controles, y la adición de IFNα redujo esta interacción independientemente de la inducción de MDN1 por IFNα (Figura 7B, C).Además, la inmunoprecipitación de HLA-A capturó H2B en células A549 (Fig. S4), lo que sugiere que esta interacción es independiente del tipo de célula.En conjunto, estos resultados respaldan las interacciones mediadas por interferón de HLA-A con H2B y MDN1.
HLA-A copurifica H2B y MDN1.Se inmunoprecipitaron inmunotransferencias endógenas representativas de H2B (A) y MDN1 (B) a partir de células Flo-1 tratadas con IFNα y se sondaron para detectar los anticuerpos indicados.Se utilizó IgG de ratón y conejo como control negativo.(C) Las cantidades relativas (entradas) de diferentes antígenos se representan mediante inmunotransferencias sondadas contra los anticuerpos indicados; se utilizó β-actina como control de carga.
Se investigaron las propiedades estructurales de una de las redes reticuladas altamente confiables inducidas por interferón, H2B-HLA-A-HMGA1.Utilizamos el modelado de dinámica molecular como un enfoque alternativo para comprender la dinámica conformacional de las proteínas involucradas en este complejo (Figura 8).Las inferencias de los datos del CLMS sugieren la posibilidad de diferentes conformaciones de las proteínas H2B, HLA-A y HMGA1.Por lo tanto, se modelaron los siguientes complejos potenciales en un medio solvente: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A y H2B-HLA-A-HMGA1.Una pantalla inicial de acoplamiento proteína-proteína utilizando el paquete MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá) sugirió posibles conformaciones que difieren entre estas proteínas (Fig. 8A).La visualización del complejo de proteínas de acoplamiento reveló varias interacciones y posibles conformaciones (Figura 5A, 8).Por lo tanto, en la Figura 8A se muestra una posible conformación (con enlaces cruzados etiquetados) y se evaluó más a fondo utilizando el proceso de modelado MD.Además, la unión de H2B o HMGA1 a HLA-A resalta la mayor afinidad de H2B por HLA-A (Fig. 8A).
Dinámica conformacional de posibles redes entre los complejos H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A y H2B-HLA-A-HMGA1.(A) El panel izquierdo es un mapa 2D (generado en el software SIM-XL) de enlaces cruzados intramoleculares (rojo) e intermoleculares (azul) (corte de enlace cruzado establecido en 3,5).Además, los residuos de entrecruzamiento identificados están marcados en las estructuras de las proteínas H2B, HLA-A y HMGA1.Las conformaciones asociadas de estas proteínas se extrajeron utilizando la tubería de acoplamiento implementada en el paquete MOE.El panel inferior izquierdo muestra las diversas conformaciones posibles de los complejos H2B-HLA-A y HMGA1-HLA-A con diferentes afinidades de unión proteína-proteína (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Desviación estándar (RMSD) de las posiciones atómicas (excluidos los átomos de hidrógeno) para cada estructura proteica.(C) Interacciones de enlaces de hidrógeno proteína-proteína intermoleculares de varios complejos simulados considerando interacciones específicas de duración ≥ 10 ns.La distancia de corte del donante-aceptor del enlace H se estableció en 3,5 Å, y el ángulo de corte del donante-aceptor de H se estableció en ≥ 160 ° –180 °.(D) Residuos marcados que forman interacciones proteína-proteína HLA-A con sus respectivas parejas, que abarcan ≥ 20 ns, extraídos de complejos ficticios HLA-A-H2B y HLA-A-HMGA1.Las estructuras de proteínas representan una estructura promedio de 100 ns MDS.(E) Interacciones entre los complejos HLA-A-H2B y HLA-A-HMGA1 en comparación con las interacciones rastreadas por simulación H2B-HLA durante 100 ns según el sitio de interacción K o S entre los dos péptidos.Complejos /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.El valor umbral para la evaluación de los enlaces cruzados se estableció en 3,0 y se tuvieron en cuenta las interacciones específicas de MDS que tomaron ≥ 10 ns.Las estructuras de proteínas se visualizaron utilizando los paquetes BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, EE. UU.) y Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).
La estabilidad de las moléculas HLA-A a lo largo del tiempo (desviación estándar; RMSD o desviación estándar; RMSF) indicó que la presencia de proteínas H2B o HMGA1 en los complejos estabilizó HLA-A (Figura 8B, Figura S5).La proteína HMGA1 se une firmemente al sitio B2M de HLA-A, induciendo la estabilidad de los aminoácidos HLA-A en el complejo HLA-A-HMGA1 o H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).en particular, se encontró que los residuos HLA ~60-90 y ~180-210 eran menos flexibles en presencia de H2B (FIG. 8B).H2B y HMGA1 mostraron una mejor unión a HLA-A en el complejo H2B-HLA-A-HMGA1 en comparación con la unión de HLA-A a H2B o HMGA1 solo (Figura 8C,D; Tabla S5).Los residuos involucrados en los enlaces de hidrógeno (alta ocupación modelada por MD ≥ 10 ns) coinciden con los sitios de interacción CLMS (residuos K o S) en el complejo, lo que sugiere que las interacciones identificadas por CLMS son muy confiables.Fiabilidad (Fig. 8E).En el modelado CLMS y MD, se encontró que los residuos HLA-A entre aproximadamente 190-210 y aproximadamente 200-220 aminoácidos se unían a H2B y HMGA1, respectivamente (FIG. 8E).
Las interacciones proteína-proteína forman redes estructurales dinámicas que median la comunicación intracelular en respuesta a ciertos estímulos.Debido a que muchos enfoques proteómicos detectan cambios en el nivel general de estado estacionario de una proteína, la dinámica de interacción proteína-proteína requiere herramientas adicionales para capturar las interfaces de unión, y CLMS es una de esas herramientas.El sistema de señalización del interferón es una red de citoquinas que permite a las células responder a una variedad de señales patológicas intrínsecas y patógenas ambientales, que culminan en la inducción de subconjuntos de proteínas inducibles por interferón.Aplicamos CLMS para determinar si se podían identificar nuevas interacciones proteína-proteína entre un panel de proteínas inducidas por interferón.Se utilizó un análisis global de entrecruzamiento de proteínas en un modelo de células Flo-1 sensibles a interferón para capturar complejos de proteínas.La extracción de péptidos trípticos de células entrecruzadas y no reticuladas permite el recuento de péptidos, el enriquecimiento de vías y la distribución de la longitud de los péptidos con una intensidad de LFQ definida.Se identificaron proteínas canónicas inducibles por interferón como control interno positivo, mientras que se observaron nuevos aductos intermoleculares e intramoleculares reticulados de proteínas canónicas inducibles por interferón como MX1, UP18, OAS3 y STAT1.Se han investigado varias características estructurales e interacciones en áreas funcionales.
Se detectó una interacción entre HLA-A, MDN1 y H2B mediante inmunotransferencia en células Flo-1 y A549 tratadas y no tratadas con IFNα.Nuestros resultados resaltan que HLA-A forma complejos con H2B de manera dependiente de IFNα.Nuestro trabajo representa una vía interesante para una mayor exploración de la co-localización de estos dos complejos.También sería interesante ampliar el enfoque CLMS a un panel de líneas celulares para identificar interacciones de proteínas mediadas por interferón independientes del tipo de célula.Finalmente, utilizamos el modelado MD como un enfoque alternativo para comprender la dinámica conformacional de las proteínas involucradas en el complejo H2BFS-HLA-A-HMGA1, que rastreó las conversaciones cruzadas intramoleculares e intermoleculares.Las inferencias de los datos del CLMS sugieren la posibilidad de diferentes conformaciones de las proteínas H2BFS, HLA-A y HMGA1.Las posibles diferentes conformaciones entre estos complejos de proteínas de acoplamiento revelaron varias interacciones similares a las observadas en el conjunto de datos CLMS.Una de las principales fortalezas de nuestro método es que permite una fácil identificación de genes altamente polimórficos que interactúan, como el HLA, por lo que será interesante estudiar las interacciones de las proteínas específicas del haplotipo HLA que de otro modo serían difíciles de estudiar.En conjunto, nuestros datos demuestran que CLMS se puede utilizar para ampliar nuestra comprensión de las redes de señalización inducidas por interferón y proporcionar una base para estudiar sistemas intercelulares más complejos en el microambiente tumoral.
Las células Flo-1 se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en DMEM (Gibco) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen), 10% de suero bovino fetal (Gibco) y se almacenaron a 37°C y 5% de CO2.Incubación.Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70-80 % antes de tratarlas con IFNα14 (fabricado por Edinburgh Protein Production Facility).Todos los demás productos químicos y reactivos se adquirieron de Sigma Aldrich a menos que se indique lo contrario.
Se cultivaron células Flo-1 en placas de 6 pocillos y al día siguiente las células se trataron con 10 ng/ml de IFNα14 durante 24 horas hasta aproximadamente un 80 % de confluencia.Las células se lavaron tres veces con PBS y se ligaron con DSS recién preparado (Thermo Fisher Scientific) (disuelto en DMSO) en PBS durante 5 minutos a 37 °C hasta una concentración final de 0,5 mM.La reacción de reticulación de DSS se reemplazó con PBS y el DSS residual se inactivó añadiendo Tris 20 mM (pH 8,0) en PBS durante 15 minutos a 37°C.Las células se recogieron mediante raspado y se recogieron en tubos de baja unión (Axygen).
El sedimento celular se lisó con 300 µl de tampón de lisis de urea (urea 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional.Todos los pasos de centrifugación se realizaron a 14.000 xg a 8°C.Centrifugar el lisado durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.Las partículas transparentes restantes se disolvieron en 150 µl del segundo tampón de lisis (urea 2 M, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 2 % (p/v)) durante 30 minutos o más hasta que se obtuvo una solución acuosa homogénea.El lisado se centrifugó durante 20 minutos y el sobrenadante se mezcló con el lisado obtenido en el paso anterior.Las concentraciones de proteínas se evaluaron mediante el ensayo Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para los procedimientos de microplacas.Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.
Se procesaron aproximadamente 100 µg de proteína reticulada soluble usando un protocolo de preparación de muestras de filtración modificado (FASP) como lo describen Wisniewski et al.69 Brevemente, la proteína se reticula con 200 µl de tampón de urea (urea 8 M en Tris 0,1 M, pH 8,5), se agita y se divide por la mitad.Todos los pasos de centrifugación se realizaron a 14.000 xg a 25°C.La primera mitad del lisado de proteínas reticuladas se transfirió a un dispositivo de filtro centrífugo Microcon de 10 kDa equipado con una membrana Ultracel-10 (Merck), seguido de centrifugación en el filtro durante 25 minutos.Luego agrega la segunda mitad de la proteína al filtro y repite los mismos pasos.La recuperación de proteínas se realizó añadiendo 100 µl de clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) 17 mM en tampón de urea.La recuperación se agitó en un termomezclador a 600 rpm durante 30 min a 37°C.Además, la columna se centrifugó y la proteína entrecruzada reducida se alquiló usando 100 µl de yodoacetamida 50 mM en tampón de urea.La reacción de alquilación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.Gire la columna, lave las paredes de la columna 3 veces con 100 µl de tampón de urea y luego centrifugue.La misma operación se realizó 3 veces usando 100 µl de bicarbonato de amonio 100 mM.Antes de la tripsinización, reemplace el tubo de recolección por uno nuevo.Añadir tampón de digestión que contenga bicarbonato de amonio 50 mM y 1 l de tripsina diluida en tampón de tripsina (Promega).La proporción de tripsina a proteína se mantuvo en aproximadamente 1:33 y las reacciones de digestión se incubaron durante la noche a 37°C en una cámara húmeda.El péptido reticulado se eluyó del filtro mediante centrifugación durante 25 minutos.La recuperación de péptidos se mejoró añadiendo 50 µl de NaCl 0,5 M al filtro, seguido de centrifugación durante 25 minutos.
Se utilizaron columnas C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) para desalar péptidos trípticos reticulados siguiendo el protocolo descrito por Bouchal et al.70 con modificaciones menores.Brevemente, las columnas de centrifugación C18 se activaron con tres lavados de ácido fórmico (FA) al 0,1% en acetonitrilo (AcN) (Merck) y dos lavados de FA al 0,1%.La columna se hidrató con FA al 0,1% durante 15 minutos.Cargue las muestras en columnas de centrifugado y lave 3 veces con 0,1% FA.Los péptidos desalados se eluyeron secuencialmente con un gradiente gradual utilizando AcN al 50 %, 80 % y 100 % en FA al 0,1 %.Las muestras se secaron en un concentrador SpeedVac Plus (Eppendorf) hasta que desapareció por completo el líquido residual.Los péptidos eluidos se disolvieron en 100 µl de ácido trifluoroacético al 0,08% en AcN al 2,5% y las concentraciones se midieron en un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Se inyectó aproximadamente 1 µg de péptido reticulado por muestra en el sistema LC-MS/MS.
Los péptidos reticulados se separaron en un sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) conectado a un espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Los péptidos reticulados se recogieron en una columna de captura C18 de precolumna µ de 300 µm de diámetro interno y 5 mm de largo empaquetada con sorbente C18 PepMap100 y sorbente PepMap de 5 µm (Thermo Scientific).Cargue el flujo de la bomba ajustado a 5 l/min de ácido trifluoroacético al 0,08% disuelto en AcN al 2,5%.Los péptidos reticulados se separaron en una columna analítica de sílice fundida con un diámetro interior de 75 μm y una longitud de 150 mm, llena con un sorbente PepMap de 2 μm (Thermo Scientific).Las fases móviles A y B consistieron en 0,1% de FA en agua y 0,1% de FA en acetonitrilo, respectivamente.El gradiente comienza en 2,5% B y aumenta linealmente hasta 40% B durante 90 minutos, luego hasta 90% B durante los siguientes 2 minutos.La composición de la fase móvil se mantuvo al 90 % de B durante 10 minutos y luego se redujo linealmente al 2,5 % de B durante 2 minutos.La columna se equilibró a 2,5 % de B durante 8 minutos antes del siguiente ciclo.Los péptidos reticulados eluidos de la columna analítica se ionizaron en una fuente de ionización por nanoelectrospray (NSI) y se inyectaron en un espectrómetro de masas Exploris 480 (Thermo Scientific).
El espectrómetro de masas Orbitrap Exploris 480 funcionó en el modo de correlación de datos positiva.Se realizó un escaneo completo en modo de sección con una resolución de 120.000 con ajustes de rango de m/z 350 Th a m/z 2000 Th.El objetivo de AGC normalizado se estableció en 300 % con un tiempo de entrada máximo de 50 ms.Se ha establecido la detección de picos monoisotópicos para péptidos.El parámetro de relajación de restricciones se establece en verdadero si se encuentran muy pocos precursores.La fuerza iónica mínima del precursor se estableció en 5,0e3 y en los experimentos se incluyeron estados de carga del precursor de hasta +8.
El tiempo de ciclo entre exploraciones principales en el modo de correlación de datos se estableció en 2,5 segundos.La exclusión de masa dinámica se estableció en 20 s después de la primera fragmentación del ion precursor.La ventana de aislamiento del precursor se fijó en 2 Th.El tipo de energía de colisión normalizada con un modo de energía de colisión fija se eligió en un escaneo MS/MS dependiente de los datos.Energía de colisión establecida en 30%.La resolución de Orbitrap se fijó en 15.000 y el objetivo de AGC en 100%.El tiempo de inyección máximo personalizado se establece en 60 milisegundos.
Antes de rastrear la red proteína-proteína en muestras entrecruzadas, procesamos los archivos sin procesar usando el paquete MaxQuant (versión 1.6.12.0)26,27 para identificar péptidos/proteínas rastreables en las muestras.Además, se realizaron análisis proteómicos similares en muestras de Flo-1 no reticuladas tratadas y no tratadas con IFNα.Se buscaron datos de MS/MS en la base de datos humana UniProt (www.uniprot.org) (cargada el 12 de agosto de 2020, contiene 75,093 entradas) utilizando el motor de búsqueda integrado Andromeda27.La búsqueda se realizó sin indicar la especificidad de la enzima y diversas modificaciones de desamidación (N, Q) y oxidación (M).Las tolerancias de masa del precursor se establecieron en 20 ppm y los iones del producto en 0,02 Da.La desviación de masa inicial y máxima se fijó en 10 ppm.La masa máxima del péptido se fijó en 4600 Da y la similitud de secuencia se fijó entre 7 y 25 aminoácidos (aa).Se realizaron análisis estadísticos adicionales utilizando el programa Perseus (versión 1.6.10.45).El contenido de proteína se calculó normalizando la intensidad espectral de la proteína (intensidad LFQ; cuantificación sin etiquetar)27 y los valores de intensidad se convirtieron a Log2.Se construyó una agrupación jerárquica de proteínas identificadas por su intensidad peptídica utilizando el paquete pheatmap (v1.0.12) en R (v 4.1.2).El análisis de enriquecimiento de la vía se realizó utilizando la base de datos de la vía Reactome para proteínas tratadas con IFNα que se activaron más de cuatro veces en comparación con las muestras no tratadas.
La identificación de entrecruzamientos químicos específicos de lisina (K) o serina (S) de complejos proteicos monitoreados por LC-MS/MS se realizó utilizando una máquina de identificación espectroscópica (SIM-XL) para péptidos entrecruzados (SIM-XL)29.En primer lugar, se investigaron las posibles interacciones entre los genes característicos de resistencia al daño del ADN (IRDS) asociados al interferón (IFN) utilizando el conjunto de datos de proteínas IRDS descrito en Padariya et al.28.La detección de todas las condiciones y repeticiones del UniProt humano completo requiere una gran cantidad de cálculos, por lo que toda la base de datos de UniProt humano (www.uniprot.org) (descargada el 12 de agosto de 2020, contiene 75 093 entradas) frente a repeticiones tratadas con IFNα.Uno de los filtros para interacciones de alta confianza.Estas interacciones de alta significancia obtenidas se ampliaron y probaron en todas las repeticiones y condiciones.
En SIM-XL, se usó DSS para el reticulante (XL) y el cambio de peso de XL y el cambio de peso de modificación se establecieron en 138,06 y 156,07, respectivamente.Se consideran los siguientes sitios de reacción de reticulación: KK, KS y KN-TERM, sin iones indicadores.Tanto las ppm de precursor como las de fragmento se establecieron en 20 y el umbral de Xrea se estableció en 0,15.Se consideró que la tripsina era completamente específica y se implementó un método de fragmentación con trampa C (HCD) de alta energía.El umbral de reducción dinámica de DB de XCorr y el número mínimo de péptidos para la reducción dinámica de DB se establecieron en 2,5 y 2, respectivamente.Otros parámetros son: probabilidad de monoisótopos y límite de coincidencia de picos, mínimo 4 residuos de AA por cadena y carga máxima de la cadena, y 3 máximos de divisiones perdidas.Los mapas 2D cosidos resultantes se analizaron en (SIM-XL) y se utilizó la representación gráfica xQuest28 para construir los mapas 2D.Los enlaces cruzados de proteínas en estructuras de proteínas se proporcionan en PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versión 2.0 Schrödinger, LLC).
Las estructuras modelo de proteínas se crearon utilizando el servidor Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 utilizando los principios de modelado de homología e implementación del "Método oculto de Markov".Phyre2 genera estructuras modelo basadas en la alineación de secuencias con estructuras proteicas conocidas.Para las proteínas H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 y MDN1, se utilizaron las estructuras de plantilla 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 y 6i2665.Además, también se consideró la estructura de AlphaFold71 MX1, UBP18 y ROBO1.La estructura de la proteína se visualizó utilizando el paquete BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, EE. UU.) y el paquete Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canadá).