Componente químico de tubo espiral de acero inoxidable 304. La estructura del ectodominio SPACA6 contiene una superfamilia conservada de proteínas asociadas con la fusión de gametos.

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Especificación estándar del tubo ASTM A240 tipo 304

Proveedores de tubos en espiral de acero inoxidable ASTM A240 304

Especificaciones ASTM A240/ASME SA240
Espesor 0,5 mm-100 mm
Diámetro externo 10 mm, 25,4 mm, 38,1 mm, 50,8 mm, 100 mm, 250 mm, 300 mm, 350 mm, etc.
Longitud 2000 mm, 2440 mm, 3000 mm, 5800 mm, 6000 mm, etc.
Superficie 2B, 2D, BA, NO.1, NO.4, NO.8, 8K, espejo, a cuadros, en relieve, línea capilar, chorro de arena, pincel, grabado, etc.
Finalizar Laminado en caliente (HR), Tubo laminado en frío (CR), 2B, 2D, BA NO(8), SATINADO (revestido con plástico)
Forma Tubo redondo Tubo cuadrado Tubo rectangular, etc.

304 Composición del tubo Ruond y características mecánicas

Calificación C Mn Si P S Cr Mo Ni N
304 Mín.
Máx.
/
0,08
/
2.0
/
0,75
/
0,045
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10,50
/
0,10
304L Mín.
Máx.
/
0,03
/
2.0
/
1.0
/
0,045
/
0.030
18.00
20.00
/ 9.00
11.00
/
304H Mín.
Máx.
0,04
0,10
/
2.0
/
0,75
0,045
/
/
0.030
18.00
20.00
/ 8.00
10,50
/
Calificación Resistencia a la tracción
(MPa)
Fuerza de producción
0,2% de prueba (MPa)
Alargamiento
(% en 50 mm)
Dureza
Rockwell B.
(HR B)
Brinell
(MEDIA PENSIÓN)
304 515 205 40 92 201
304L 515 205 40 90 187
304H 515 205 40 92 201

Dimensiones Estándar, tabla de pesos y tablas de tamaños del tubo de acero inoxidable 304

Tamaño del tubo SS 304 (mm) Peso del tubo SS304 por unidad de área (kg/m)
6*1 0,125
6*1,5 0,168
8*1 0,174
8*1,5 0.243
10*1 0.224
10*1,5 0.318
12*1 0.274
12*1,5 0,392
12*2 0,498
14*1 0.324
14*2 0,598
14*3 0.822
16*2 0,697
16*3 0.971
17*3 1.046
18*1 0.423
18*1,5 0,617
18*2 0,797
18*3 1.121
20*1 0.473
20*2 0,897
20*3 1.27
21*3 1.345
22*2 0.996
22*2,5 1.214

SPACA6 es una proteína de superficie expresada en los espermatozoides que es fundamental para la fusión de gametos durante la reproducción sexual de los mamíferos.A pesar de este papel fundamental, la función específica de SPACA6 no se comprende bien.Aclaramos la estructura cristalina del dominio extracelular de SPACA6 a una resolución de 2,2 Å, revelando una proteína de dos dominios compuesta por un haz de cuatro cadenas y sándwiches β similares a Ig unidos por conectores casi flexibles.Esta estructura se parece a IZUMO1, otra proteína asociada a la fusión de gametos, lo que convierte a SPACA6 e IZUMO1 en miembros fundadores de la superfamilia de proteínas asociadas a la fertilización denominadas en el presente documento superfamilia IST.La superfamilia IST está definida estructuralmente por su haz de cuatro hélices retorcidas y un par de motivos CXXC unidos por disulfuro.Una búsqueda AlphaFold basada en la estructura del proteoma humano identificó miembros proteicos adicionales de esta superfamilia;En particular, muchas de estas proteínas participan en la fusión de gametos.La estructura SPACA6 y su relación con otros miembros de la superfamilia IST proporcionan el eslabón perdido en nuestro conocimiento sobre la fusión de gametos de mamíferos.
Toda vida humana comienza con dos gametos haploides separados: el espermatozoide del padre y el óvulo de la madre.Este espermatozoide es el ganador de un intenso proceso de selección durante el cual millones de espermatozoides pasan por el tracto genital femenino, superan diversos obstáculos1 y se capacitan, lo que mejora su motilidad y el proceso de los componentes de la superficie2,3,4.Incluso si el espermatozoide y el ovocito se encuentran, el proceso aún no ha terminado.El ovocito está rodeado por una capa de células del cúmulo y una barrera glicoproteica llamada zona pelúcida, a través de la cual deben pasar los espermatozoides para ingresar al ovocito.Los espermatozoides utilizan una combinación de moléculas de adhesión a la superficie y enzimas secretadas y asociadas a la membrana para superar estas barreras finales5.Estas moléculas y enzimas se almacenan principalmente en la membrana interna y la matriz acrosómica y se detectan cuando la membrana externa del espermatozoide se lisa durante la reacción acrosómica6.El último paso en este intenso viaje es el evento de fusión espermatozoide-óvulo, en el que las dos células fusionan sus membranas para convertirse en un único organismo diploide7.Aunque este proceso es innovador en la reproducción humana, las interacciones moleculares necesarias no se conocen bien.
Además de la fertilización de gametos, se ha estudiado ampliamente la química de la fusión de dos bicapas lipídicas.En general, la fusión de membranas es un proceso energéticamente desfavorable que requiere que un catalizador proteico experimente un cambio de conformación estructural que acerca dos membranas, rompiendo su continuidad y provocando la fusión8,9.Estos catalizadores proteicos se conocen como fusógenos y se han encontrado en innumerables sistemas de fusión.Son necesarios para la entrada viral a las células huésped (p. ej., gp160 en VIH-1, pico en coronavirus, hemaglutinina en virus de influenza)10,11,12 placentaria (sincitina)13,14,15 y fusiones formadoras de gametos en eucariotas inferiores ( HAP2/GCS1 en plantas, protistas y artrópodos) 16,17,18,19.Aún no se han descubierto los fusógenos para los gametos humanos, aunque se ha demostrado que varias proteínas son críticas para la unión y fusión de los gametos.La CD9 expresada en ovocitos, una proteína transmembrana necesaria para la fusión de gametos de ratón y humanos, fue la primera en descubrirse 21,22,23.Aunque su función precisa aún no está clara, parece probable que tenga un papel en la adhesión, la estructura de los focos de adhesión en las microvellosidades del óvulo y/o la localización correcta de las proteínas de la superficie del ovocito 24,25,26.Las dos proteínas más típicas que son críticas para la fusión de gametos son la proteína del espermatozoide IZUMO127 y la proteína del ovocito JUNO28, y su asociación mutua es un paso importante en el reconocimiento y adhesión de los gametos antes de la fusión.Los ratones macho Izumo1 knockout y las hembras Juno knockout son completamente estériles; en estos modelos los espermatozoides ingresan al espacio perivitelino pero los gametos no se fusionan.De manera similar, la confluencia se redujo cuando los gametos fueron tratados con anticuerpos anti-IZUMO1 o JUNO27,29 en experimentos de fertilización in vitro en humanos.
Recientemente, se ha descubierto un grupo recién descubierto de proteínas expresadas en espermatozoides fenotípicamente similares a IZUMO1 y JUNO20,30,31,32,33,34,35.La proteína 6 asociada a la membrana acrosómica del esperma (SPACA6) ha sido identificada como esencial para la fertilización en un estudio de mutagénesis murina a gran escala.La inserción del transgén en el gen Spaca6 produce espermatozoides no fusionables, aunque estos espermatozoides se infiltran en el espacio perivitelino 36 .Estudios posteriores en ratones confirmaron que Spaca6 es necesaria para la fusión de gametos 30,32.SPACA6 se expresa casi exclusivamente en los testículos y tiene un patrón de localización similar al de IZUMO1, concretamente dentro de la íntima de los espermatozoides antes de la reacción acrosómica, y luego migra a la región ecuatorial después de la reacción acrosómica 30,32.Los homólogos de Spaca6 existen en una variedad de mamíferos y otros eucariotas 30 y su importancia para la fusión de gametos humanos ha sido demostrada mediante la inhibición de la fertilización humana in vitro por resistencia a SPACA6 30.A diferencia de IZUMO1 y JUNO, los detalles de la estructura, interacciones y función de SPACA6 siguen sin estar claros.
Para comprender mejor el proceso fundamental que subyace a la fusión de espermatozoides y óvulos humanos, lo que nos permitirá informar sobre desarrollos futuros en planificación familiar y tratamientos de fertilidad, realizamos estudios estructurales y bioquímicos de SPACA6.La estructura cristalina del dominio extracelular de SPACA6 muestra un haz de cuatro hélices (4HB) y un dominio similar a una inmunoglobulina (tipo Ig) conectados por regiones casi flexibles.Como se predijo en estudios previos,7,32,37 la estructura del dominio de SPACA6 es similar a la del IZUMO1 humano, y las dos proteínas comparten un motivo inusual: 4HB con una superficie helicoidal triangular y un par de motivos CXXC unidos por disulfuro.Proponemos que IZUMO1 y SPACA6 ahora definan una superfamilia de proteínas más grande y estructuralmente relacionada asociada con la fusión de gametos.Utilizando características exclusivas de la superfamilia, llevamos a cabo una búsqueda exhaustiva del proteoma humano estructural AlphaFold, identificando miembros adicionales de esta superfamilia, incluidos varios miembros involucrados en la fusión y/o fertilización de gametos.Ahora parece que existe un pliegue estructural común y una superfamilia de proteínas asociadas con la fusión de gametos, y nuestra estructura proporciona un mapa molecular de este importante aspecto del mecanismo de fusión de gametos humanos.
SPACA6 es una proteína transmembrana de paso único con un glicano unido a N y seis enlaces disulfuro putativos (Figuras S1a y S2).Expresamos el dominio extracelular de SPACA6 humano (residuos 27-246) en células de Drosophila S2 y purificamos la proteína mediante cromatografía de afinidad por níquel, intercambio catiónico y exclusión por tamaño (Fig. S1b).El ectodominio SPACA6 purificado es muy estable y homogéneo.El análisis mediante cromatografía de exclusión por tamaño combinada con dispersión de luz poligonal (SEC-MALS) reveló un pico con un peso molecular calculado de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Esto es consistente con el tamaño del ectodominio monomérico SPACA6, lo que indica que no se produjo oligomerización durante la purificación.Además, la espectroscopia de dicroísmo circular (CD) reveló una estructura mixta α/β con un punto de fusión de 51,3 °C (Fig. S1d,e).La deconvolución de los espectros de CD reveló un 38,6% de elementos de hélice α y un 15,8% de elementos de cadena β (Figura S1d).
El ectodominio SPACA6 se cristalizó mediante siembra de matriz aleatoria38, lo que dio como resultado un conjunto de datos con una resolución de 2,2 Å (Tabla 1 y Figura S3).Utilizando una combinación de sustitución molecular basada en fragmentos y datos de fase SAD con exposición a bromuro para la determinación de la estructura (Tabla 1 y Figura S4), el modelo refinado final consta de los residuos 27–246.En el momento en que se determinó la estructura, no había estructuras experimentales o AlphaFold disponibles.El ectodominio SPACA6 mide 20 Å × 20 Å × 85 Å, consta de siete hélices y nueve hebras β y tiene un pliegue terciario alargado estabilizado por seis enlaces disulfuro (Fig. 1a, b).La débil densidad de electrones al final de la cadena lateral de Asn243 indica que este residuo es una glicosilación ligada a N.La estructura consta de dos dominios: un haz de cuatro hélices N-terminal (4HB) y un dominio tipo Ig C-terminal con una región bisagra intermedia entre ellos (Fig. 1c).
a Estructura del dominio extracelular de SPACA6.Diagrama de tiras del dominio extracelular de SPACA6, el color de la cadena desde el extremo N al C de azul oscuro a rojo oscuro.Las cisteínas implicadas en los enlaces disulfuro están resaltadas en magenta.b Topología del dominio extracelular de SPACA6.Utilice el mismo esquema de color que en la Figura 1a.c Dominio extracelular SPACA6.Los gráficos de tiras de dominio tipo 4HB, bisagra y tipo Ig son de color naranja, verde y azul, respectivamente.Las capas no están dibujadas a escala.
El dominio 4HB de SPACA6 incluye cuatro hélices principales (hélices 1 a 4), que están dispuestas en forma de hélice (Fig. 2a), alternando entre interacciones antiparalelas y paralelas (Fig. 2b).Una pequeña hélice adicional de una sola vuelta (hélice 1′) se coloca perpendicular al haz, formando un triángulo con las hélices 1 y 2. Este triángulo está ligeramente deformado en el empaquetamiento helicoidalmente retorcido del empaquetamiento relativamente denso de las hélices 3 y 4 ( Figura 2a).
Gráfico de tiras de terminales N 4HB.b Vista superior de un conjunto de cuatro hélices, cada hélice resaltada en azul oscuro en el extremo N y en rojo oscuro en el extremo C.c Diagrama de rueda en espiral de arriba hacia abajo para 4HB, en el que cada residuo se muestra como un círculo etiquetado con un código de aminoácido de una sola letra;sólo los cuatro aminoácidos en la parte superior de la rueda están numerados.Los residuos no polares están coloreados en amarillo, los residuos polares sin carga están coloreados en verde, los residuos cargados positivamente están coloreados en azul y los residuos cargados negativamente están coloreados en rojo.d Caras triangulares del dominio 4HB, con 4HB en naranja y bisagras en verde.Ambos recuadros muestran enlaces disulfuro en forma de varilla.
El 4HB se concentra en un núcleo hidrofóbico interno compuesto principalmente de residuos alifáticos y aromáticos (Fig. 2c).El núcleo contiene un enlace disulfuro entre Cys41 y Cys55 que une las hélices 1 y 2 en un triángulo elevado superior (Fig. 2d).Se formaron dos enlaces disulfuro adicionales entre el motivo CXXC en Helix 1 'y otro motivo CXXC que se encuentra en la punta de la horquilla β en la región de la bisagra (Fig. 2d).Un residuo de arginina conservador con una función desconocida (Arg37) se encuentra dentro de un triángulo hueco formado por las hélices 1', 1 y 2. Los átomos de carbono alifáticos Cβ, Cγ y Cδ Arg37 interactúan con el núcleo hidrofóbico y sus grupos guanidina se mueven cíclicamente. entre las hélices 1 'y 1 a través de interacciones entre la columna vertebral de Thr32 y la cadena lateral (Fig. S5a, b).Tyr34 se extiende hacia la cavidad dejando dos pequeñas cavidades a través de las cuales Arg37 puede interactuar con el solvente.
Los dominios sándwich β tipo Ig son una gran superfamilia de proteínas que comparten la característica común de dos o más láminas β anfipáticas multicatenarias que interactúan a través de un núcleo hidrófobo 39. El dominio tipo Ig C-terminal de SPACA6 tiene el mismo patrón y consta de dos capas (Fig. S6a).La hoja 1 es una hoja β de cuatro hebras (hebras D, F, H e I) donde las hebras F, H e I forman una disposición antiparalela y las hebras I y D adoptan una interacción paralela.La Tabla 2 es una pequeña lámina beta bicatenaria antiparalela (hebras E y G).Se observó un enlace disulfuro interno entre el extremo C de la cadena E y el centro de la cadena H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Este enlace disulfuro es análogo al enlace disulfuro en el dominio sándwich β de la inmunoglobulina40,41.
La lámina β de cuatro hilos se retuerce en toda su longitud, formando bordes asimétricos que difieren en forma y electrostática.El borde más delgado es una superficie ambiental hidrofóbica plana que se destaca en comparación con las superficies restantes desiguales y electrostáticamente diversas en SPACA6 (Fig. S6b, c).Un halo de grupos carbonilo/amino del esqueleto expuesto y cadenas laterales polares rodea la superficie hidrófoba (Fig. S6c).El margen más amplio está cubierto por un segmento helicoidal cubierto que bloquea la porción N-terminal del núcleo hidrofóbico y forma tres enlaces de hidrógeno con el grupo polar abierto de la cadena principal F (Fig. S6d).La porción C-terminal de este borde forma una bolsa grande con un núcleo hidrófobo parcialmente expuesto.La bolsa está rodeada de cargas positivas debido a tres conjuntos de residuos dobles de arginina (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 y Arg212-Arg214) y una histidina central (His220) (Figura S6e).
La región bisagra es un segmento corto entre el dominio helicoidal y el dominio tipo Ig, que consta de una capa β antiparalela de tres hebras (hebras A, B y C), una pequeña hélice 310 y varios segmentos helicoidales aleatorios largos.(Figura S7).Una red de contactos covalentes y electrostáticos en la región bisagra parece estabilizar la orientación entre 4HB y el dominio tipo Ig.La red se puede dividir en tres partes.La primera parte incluye dos motivos CXXC (27CXXC30 y 139CXXC142) que forman un par de enlaces disulfuro entre la horquilla β en la bisagra y la hélice 1' en 4HB.La segunda parte incluye interacciones electrostáticas entre el dominio tipo Ig y la bisagra.Glu132 en la bisagra forma un puente salino con Arg233 en el dominio similar a Ig y Arg135 en la bisagra.La tercera parte incluye un enlace covalente entre el dominio tipo Ig y la región bisagra.Dos enlaces disulfuro (Cys124-Cys147 y Cys128-Cys153) conectan el bucle de bisagra a un conector que se estabiliza mediante interacciones electrostáticas entre Gln131 y el grupo funcional principal, lo que permite el acceso al primer dominio similar a Ig.cadena.
La estructura del ectodominio SPACA6 y las estructuras individuales de los dominios 4HB y similares a Ig se utilizaron para buscar registros estructuralmente similares en bases de datos de proteínas 42 .Identificamos coincidencias con puntuaciones altas de Dali Z, desviaciones estándar pequeñas y puntuaciones LALI grandes (siendo esta última el número de residuos estructuralmente equivalentes).Si bien los primeros 10 resultados de la búsqueda completa de ectodominio (Tabla S1) tuvieron una puntuación Z aceptable de >842, una búsqueda de 4HB o dominio similar a Ig solo mostró que la mayoría de estos resultados correspondían únicamente a sándwiches β.un pliegue ubicuo que se encuentra en muchas proteínas.Las tres búsquedas en Dali arrojaron un solo resultado: IZUMO1.
Durante mucho tiempo se ha sugerido que SPACA6 e IZUMO1 comparten similitudes estructurales7,32,37.Aunque los ectodominios de estas dos proteínas asociadas a la fusión de gametos comparten solo el 21% de identidad de secuencia (Figura S8a), la evidencia compleja, que incluye un patrón de enlace disulfuro conservado y un dominio tipo Ig C-terminal predicho en SPACA6, permitió los primeros intentos de construir un modelo de homología de A un ratón SPACA6 utilizando IZUMO1 como plantilla37.Nuestra estructura confirma estas predicciones y muestra el verdadero grado de similitud.De hecho, las estructuras SPACA6 e IZUMO137,43,44 comparten la misma arquitectura de dos dominios (Fig. S8b) con dominios sándwich β similares a 4HB y Ig conectados por una región de bisagra (Fig. S8c).
IZUMO1 y SPACA6 4HB tienen diferencias comunes con los haces en espiral convencionales.Los 4HB típicos, como los que se encuentran en los complejos proteicos SNARE implicados en la fusión endosómica 45,46, tienen hélices espaciadas uniformemente que mantienen una curvatura constante alrededor de un eje central 47. En contraste, los dominios helicoidales tanto en IZUMO1 como en SPACA6 estaban distorsionados, con curvatura variable y embalaje desigual (Figura S8d).La torsión, probablemente provocada por el triángulo formado por las hélices 1′, 1 y 2, queda retenida en IZUMO1 y SPACA6 y estabilizada por el mismo motivo CXXC en la hélice 1′.Sin embargo, el enlace disulfuro adicional que se encuentra en SPACA6 (Cys41 y Cys55 que unen covalentemente las hélices 1 y 2 anteriores) crea un vértice más agudo en el vértice del triángulo, lo que hace que SPACA6 sea más retorcido que IZUMO1, con triángulos de cavidad más pronunciados.Además, IZUMO1 carece de Arg37 observado en el centro de esta cavidad en SPACA6.Por el contrario, IZUMO1 tiene un núcleo hidrofóbico más típico de residuos alifáticos y aromáticos.
IZUMO1 tiene un dominio similar a Ig que consta de una hoja β de doble y cinco cadenas43.La hebra adicional en IZUMO1 reemplaza la bobina en SPACA6, que interactúa con la hebra F para limitar los enlaces de hidrógeno de la cadena principal.Un punto de comparación interesante es la carga superficial prevista de los dominios tipo Ig de las dos proteínas.La superficie IZUMO1 tiene más carga negativa que la superficie SPACA6.Una carga adicional se encuentra cerca del extremo C frente a la membrana del espermatozoide.En SPACA6, las mismas regiones eran más neutras o cargadas positivamente (Fig. S8e).Por ejemplo, la superficie hidrófoba (bordes más delgados) y los hoyos cargados positivamente (bordes más anchos) en SPACA6 están cargados negativamente en IZUMO1.
Aunque la relación y los elementos de la estructura secundaria entre IZUMO1 y SPACA6 están bien conservados, la alineación estructural de los dominios similares a Ig mostró que los dos dominios difieren en su orientación general entre sí (Fig. S9).El haz espiral de IZUMO1 está curvado alrededor del sándwich β, creando la forma de "bumerang" descrita anteriormente a aproximadamente 50 ° del eje central.Por el contrario, el haz helicoidal en SPACA6 estaba inclinado unos 10° en la dirección opuesta.Es probable que las diferencias en estas orientaciones se deban a diferencias en la región de la bisagra.A nivel de secuencia primaria, IZUMO1 y SPACA6 comparten poca similitud de secuencia en la bisagra, con la excepción de los residuos de cisteína, glicina y ácido aspártico.Como resultado, los enlaces de hidrógeno y las redes electrostáticas son completamente diferentes.IZUMO1 y SPACA6 comparten elementos de estructura secundaria de lámina β, aunque las cadenas en IZUMO1 son mucho más largas y la hélice 310 (hélice 5) es exclusiva de SPACA6.Estas diferencias dan como resultado diferentes orientaciones de dominio para dos proteínas por lo demás similares.
Nuestra búsqueda en el servidor Dali reveló que SPACA6 e IZUMO1 son las únicas dos estructuras determinadas experimentalmente almacenadas en la base de datos de proteínas que tienen este pliegue 4HB particular (Tabla S1).Más recientemente, DeepMind (Alphabet/Google) ha desarrollado AlphaFold, un sistema basado en redes neuronales que puede predecir con precisión las estructuras 3D de proteínas a partir de secuencias primarias48.Poco después de que resolviéramos la estructura SPACA6, se lanzó la base de datos AlphaFold, que proporciona modelos estructurales predictivos que cubren el 98,5 % de todas las proteínas del proteoma humano48,49.Utilizando nuestra estructura SPACA6 resuelta como modelo de búsqueda, una búsqueda de homología estructural para el modelo en el proteoma humano AlphaFold identificó candidatos con posibles similitudes estructurales con SPACA6 e IZUMO1.Dada la increíble precisión de AlphaFold en la predicción de SPACA6 (Fig. S10a), especialmente el ectodominio de 1,1 Å rms en comparación con nuestra estructura resuelta (Fig. S10b), podemos estar seguros de que las coincidencias de SPACA6 identificadas probablemente sean precisas.
Anteriormente, PSI-BLAST buscó el grupo IZUMO1 con otras tres proteínas asociadas a los espermatozoides: IZUMO2, IZUMO3 e IZUMO450.AlphaFold predijo que estas proteínas de la familia IZUMO se pliegan en el dominio 4HB con el mismo patrón de enlace disulfuro que IZUMO1 (Figuras 3a y S11), aunque carecen de un dominio similar a Ig.Se plantea la hipótesis de que IZUMO2 e IZUMO3 son proteínas de membrana unilaterales similares a IZUMO1, mientras que IZUMO4 parece secretarse.No se han determinado las funciones de las proteínas IZUMO 2, 3 y 4 en la fusión de gametos.Se sabe que IZUMO3 desempeña un papel en la biogénesis del acrosoma durante el desarrollo del esperma51 y se ha descubierto que la proteína IZUMO forma un complejo50.La conservación de las proteínas IZUMO en mamíferos, reptiles y anfibios sugiere que su función potencial es consistente con la de otras proteínas conocidas asociadas a la fusión de gametos, como DCST1/2, SOF1 y FIMP.
Diagrama de la arquitectura de dominio de la superfamilia IST, con los dominios 4HB, bisagra y tipo Ig resaltados en naranja, verde y azul, respectivamente.IZUMO4 tiene una región C-terminal única que parece negra.Los enlaces disulfuro confirmados y supuestos se muestran mediante líneas continuas y de puntos, respectivamente.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) y TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) se muestran en la misma gama de colores que el panel A. Los enlaces disulfuro se muestran en magenta.No se muestran las hélices transmembrana TMEM95, IZUMO2 e IZUMO3.
A diferencia de la proteína IZUMO, se cree que otras proteínas SPACA (es decir, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 y SPACA9) son estructuralmente diferentes de SPACA6 (Fig. S12).Sólo SPACA9 tiene 4HB, pero no se espera que tenga la misma orientación paralela-antiparalela o el mismo enlace disulfuro que SPACA6.Sólo SPACA1 tiene un dominio similar a Ig.AlphaFold predice que SPACA3, SPACA4 y SPACA5 tienen una estructura completamente diferente a la de SPACA6.Curiosamente, también se sabe que SPACA4 desempeña un papel en la fertilización, pero en mayor medida que SPACA6, facilitando en cambio la interacción entre los espermatozoides y la zona pelúcida del ovocito52.
Nuestra búsqueda AlphaFold encontró otra coincidencia para IZUMO1 y SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, una única proteína transmembrana específica de los espermatozoides, vuelve infértiles a los ratones macho cuando se les realiza una ablación 32,33.Los espermatozoides que carecían de TMEM95 tenían morfología, motilidad y capacidad normales para penetrar la zona pelúcida y unirse a la membrana del óvulo, pero no podían fusionarse con la membrana del ovocito.Estudios anteriores han demostrado que TMEM95 comparte similitudes estructurales con IZUMO133.De hecho, el modelo AlphaFold confirmó que TMEM95 es un 4HB con el mismo par de motivos CXXC que IZUMO1 y SPACA6 y el mismo enlace disulfuro adicional entre las hélices 1 y 2 que se encuentra en SPACA6 (Fig. 3a y S11).Aunque TMEM95 carece de un dominio similar a Ig, tiene una región con un patrón de enlace disulfuro similar a las regiones bisagra SPACA6 e IZUMO1 (Fig. 3b).En el momento de la publicación de este manuscrito, el servidor de preimpresión informó la estructura de TMEM95, confirmando el resultado de AlphaFold53.TMEM95 es muy similar a SPACA6 e IZUMO1 y ya está conservado evolutivamente en anfibios (Fig. 4 y S13).
La búsqueda PSI-BLAST utilizó las bases de datos NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP y SOF1 para determinar la posición de estas secuencias en el árbol de la vida.Las distancias entre los puntos de bifurcación no se muestran a escala.
La sorprendente similitud estructural general entre SPACA6 e IZUMO1 sugiere que son miembros fundadores de una superfamilia estructural conservada que incluye las proteínas TMEM95 e IZUMO 2, 3 y 4.miembros conocidos: IZUMO1, SPACA6 y TMEM95.Debido a que sólo unos pocos miembros poseen dominios similares a Ig, el sello distintivo de la superfamilia IST es el dominio 4HB, que tiene características únicas comunes a todas estas proteínas: 1) 4HB enrollado con hélices dispuestas en una alternancia antiparalela/paralela (Fig. . 5a), 2) el haz tiene una cara triangular que consta de dos hélices dentro del haz y una tercera hélice vertical (área clave de la Fig. (Fig. 5c). Se sabe que el motivo CXXC, que se encuentra en proteínas similares a la tiorredoxina, funciona como sensor redox 54,55,56, mientras que el motivo en los miembros de la familia IST puede asociarse con proteínas disulfuro isomerasas como ERp57 en la fusión de gametos.
Los miembros de la superfamilia IST se definen por tres rasgos característicos del dominio 4HB: cuatro hélices que alternan entre orientación paralela y antiparalela, caras de haz helicoidal bat-triangular y un motivo doble ca CXXC formado entre moléculas pequeñas.) Hélices N-terminales (naranja) y horquilla β de la región bisagra (verde).
Dada la similitud entre SPACA6 e IZUMO1, se probó la capacidad del primero para unirse a IZUMO1 o JUNO.La interferometría de biocapa (BLI) es un método de unión de base cinética que se ha utilizado previamente para cuantificar la interacción entre IZUMO1 y JUNO.Después de la incubación del sensor marcado con biotina con IZUMO1 como cebo con una alta concentración de analito JUNO, se detectó una fuerte señal (Fig. S14a), que indica un cambio inducido por la unión en el espesor del biomaterial adherido a la punta del sensor.Señales similares (es decir, JUNO acoplado al sensor como cebo contra el analito IZUMO1) (Fig. S14b).No se detectó señal cuando se usó SPACA6 como analito contra IZUMO1 unido al sensor o JUNO unido al sensor (Figura S14a, b).La ausencia de esta señal indica que el dominio extracelular de SPACA6 no interactúa con el dominio extracelular de IZUMO1 o JUNO.
Debido a que el ensayo BLI se basa en la biotinilación de residuos de lisina libres en la proteína del cebo, esta modificación puede evitar la unión si los residuos de lisina están involucrados en la interacción.Además, la orientación de la unión con respecto al sensor puede crear obstáculos estéricos, por lo que también se realizaron ensayos de extracción convencionales en los ectodominios recombinantes SPACA6, IZUMO1 y JUNO.A pesar de esto, SPACA6 no precipitó con IZUMO1 etiquetado con His o JUNO etiquetado con His (Fig. S14c, d), lo que indica que no hay interacción consistente con la observada en los experimentos de BLI.Como control positivo, confirmamos la interacción de JUNO con His IZUMO1 marcado (Figuras S14e y S15).
A pesar de la similitud estructural entre SPACA6 e IZUMO1, la incapacidad de SPACA6 para unirse a JUNO no es sorprendente.La superficie del IZUMO1 humano tiene más de 20 residuos que interactúan con JUNO, incluidos residuos de cada una de las tres regiones (aunque la mayoría de ellos están ubicados en la región bisagra) (Fig. S14f).De estos residuos, sólo uno se conserva en SPACA6 (Glu70).Si bien muchas sustituciones de residuos conservaron sus propiedades bioquímicas originales, el residuo esencial Arg160 en IZUMO1 fue reemplazado por el Asp148 cargado negativamente en SPACA6;Estudios anteriores han demostrado que la mutación Arg160Glu en IZUMO1 suprime casi por completo la unión a JUNO43.Además, la diferencia en la orientación del dominio entre IZUMO1 y SPACA6 aumentó significativamente el área de superficie del sitio de unión de JUNO de la región equivalente en SPACA6 (Fig. S14g).
A pesar de la conocida necesidad de SPACA6 para la fusión de gametos y su similitud con IZUMO1, SPACA6 no parece tener una función de unión a JUNO equivalente.Por lo tanto, hemos buscado combinar nuestros datos estructurales con evidencia de importancia proporcionada por la biología evolutiva.La alineación de secuencias de homólogos de SPACA6 muestra la conservación de la estructura común más allá de los mamíferos.Por ejemplo, los residuos de cisteína están presentes incluso en anfibios emparentados lejanamente (Fig. 6a).Utilizando el servidor ConSurf, se asignaron datos de retención de alineación de secuencias múltiples de 66 secuencias a la superficie SPACA6.Este tipo de análisis puede mostrar qué residuos se han conservado durante la evolución de las proteínas y puede indicar qué regiones de la superficie desempeñan un papel en la función.
a Alineamiento de secuencia de ectodominios SPACA6 de 12 especies diferentes preparado con CLUSTAL OMEGA.Según el análisis de ConSurf, las posiciones más conservadoras están marcadas en azul.Los residuos de cisteína están resaltados en rojo.Los límites de dominio y los elementos de la estructura secundaria se muestran en la parte superior de la alineación, donde las flechas indican cadenas β y las ondas indican hélices.Los Identificadores de Acceso NCBI que contienen las secuencias son: humano (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), mono capuchino (Cebus mimic, XP_017359366), caballo (Equus caballus, XP_023506102), orca (Orcinus orca3_23 XP_03 2_034).), oveja (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), perro (Canis lupus familyis, XP_025277208), ratón (Mus musculus, NP_001156381), demonio de Tasmania (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), ornitorrinco, 8 ) , 61_89 y Rana Toro (Bufo bufo, XP_040282113).La numeración se basa en el orden humano.b Representación de superficie de la estructura SPACA6 con 4HB en la parte superior y un dominio similar a Ig en la parte inferior, colores basados ​​en estimaciones de conservación del servidor ConSurf.Las partes mejor conservadas están en azul, las partes moderadamente conservadas están en blanco y las menos conservadas están en amarillo.cisteína púrpura.En el recuadro etiquetado como parches 1, 2 y 3 se muestran tres parches de superficie que demuestran un alto nivel de protección. En el recuadro de la parte superior derecha se muestra una caricatura de 4HB (mismo esquema de color).
La estructura SPACA6 tiene tres regiones superficiales altamente conservadas (Fig. 6b).El parche 1 abarca 4HB y la región bisagra y contiene dos puentes disulfuro CXXC conservados, una red bisagra Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7) y tres residuos aromáticos externos conservados (Phe31, Tyr73, Phe137)).un borde más ancho del dominio similar a Ig (Fig. S6e), que representa varios residuos cargados positivamente en la superficie del espermatozoide.Curiosamente, este parche contiene un epítopo de anticuerpo que previamente se ha demostrado que interfiere con la función SPACA6 30.La región 3 abarca la bisagra y un lado del dominio tipo Ig;esta región contiene prolinas conservadas (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) y residuos polares/cargados orientados hacia afuera.Sorprendentemente, la mayoría de los residuos en la superficie de 4HB son muy variables (Fig. 6b), aunque el pliegue se conserva en todo el homólogo SPACA6 (como lo indica el conservadurismo del núcleo hidrofóbico del haz) y más allá de la superfamilia IST.
Aunque esta es la región más pequeña en SPACA6 con la menor cantidad de elementos de estructura secundaria detectables, muchos remanentes de la región bisagra (incluida la región 3) están altamente conservados entre los homólogos de SPACA6, lo que puede indicar que la orientación del haz helicoidal y el sándwich β desempeñan un papel.como conservador.Sin embargo, a pesar de los extensos enlaces de hidrógeno y las redes electrostáticas en la región bisagra de SPACA6 e IZUMO1, se puede ver evidencia de flexibilidad intrínseca en la alineación de las múltiples estructuras permitidas de IZUMO137,43,44.La alineación de los dominios individuales se superpuso bien, pero la orientación de los dominios entre sí varió de 50 ° a 70 ° desde el eje central (Fig. S16).Para comprender la dinámica conformacional de SPACA6 en solución, se realizaron experimentos SAXS (Fig. S17a, b).La reconstrucción ab initio del ectodominio SPACA6 se conformó a una estructura cristalina de varilla (Fig. S18), aunque el gráfico de Kratky mostró cierto grado de flexibilidad (Fig. S17b).Esta conformación contrasta con IZUMO1, en el que la proteína libre asume una forma de boomerang tanto en la red como en la solución43.
Para identificar específicamente la región flexible, se realizó espectroscopía de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (H-DXMS) en SPACA6 y se comparó con los datos obtenidos previamente en IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 es claramente más flexible que IZUMO1, como lo demuestra el mayor intercambio de deuterio en toda la estructura después de 100.000 s de intercambio.En ambas estructuras, la parte C-terminal de la región bisagra muestra un alto nivel de intercambio, lo que probablemente permite una rotación limitada de los dominios tipo 4HB y Ig entre sí.Curiosamente, la parte C-terminal de la bisagra SPACA6, que consta del residuo 147CDLPLDCP154, es una región 3 altamente conservada (Fig. 6b), lo que posiblemente indica que la flexibilidad entre dominios es una característica evolutivamente conservada de SPACA6.Según el análisis de flexibilidad, los datos de fusión térmica de CD mostraron que SPACA6 (Tm = 51,2 °C) es menos estable que IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e y S19).
a Imágenes H-DXMS de SPACA6 yb IZUMO1.El porcentaje de intercambio de deuterio se determinó en los momentos indicados.Los niveles de intercambio de hidrógeno-deuterio se indican mediante colores en una escala de gradiente que va del azul (10%) al rojo (90%).Las cajas negras representan áreas de alto intercambio.Los límites de 4HB, bisagra y dominio tipo Ig observados en la estructura cristalina se muestran encima de la secuencia primaria.Los niveles de intercambio de deuterio a los 10 s, 1000 s y 100 000 s se trazaron en un gráfico de tiras superpuesto a las superficies moleculares transparentes de SPACA6 e IZUMO1.Las partes de estructuras con un nivel de intercambio de deuterio inferior al 50% están coloreadas en blanco.Las áreas por encima del 50 % de intercambio H-DXMS están coloreadas en una escala de gradiente.
El uso de CRISPR/Cas9 y estrategias genéticas de desactivación de genes de ratón ha llevado a la identificación de varios factores importantes para la unión y fusión de espermatozoides y óvulos.Aparte de la interacción bien caracterizada de IZUMO1-JUNO y la estructura CD9, la mayoría de las proteínas asociadas con la fusión de gametos siguen siendo estructural y funcionalmente enigmáticas.La caracterización biofísica y estructural de SPACA6 es otra pieza del rompecabezas molecular de adhesión/fusión durante la fertilización.
SPACA6 y otros miembros de la superfamilia IST parecen estar altamente conservados en mamíferos, así como en aves, reptiles y anfibios individuales;de hecho, se cree que SPACA6 incluso es necesaria para la fertilización en el pez cebra 59. Esta distribución es similar a otras proteínas conocidas asociadas a la fusión de gametos, como DCST134, DCST234, FIMP31 y SOF132, lo que sugiere que estos factores son deficientes en HAP2 (también conocidas como GCS1) proteínas que son responsables de la actividad catalítica de muchos protistas., plantas y artrópodos.Proteínas de fusión fertilizadas 60, 61. A pesar de la fuerte similitud estructural entre SPACA6 e IZUMO1, la eliminación de genes que codifican cualquiera de estas proteínas resultó en infertilidad en ratones macho, lo que indica que sus funciones en la fusión de gametos no están duplicadas..En términos más generales, ninguna de las proteínas espermáticas conocidas necesarias para la fase de adhesión de la fusión es redundante.
Sigue siendo una cuestión abierta si SPACA6 (y otros miembros de la superfamilia IST) participan en uniones intergaméticas, forman redes intragaméticas para reclutar proteínas importantes para puntos de fusión o tal vez incluso actúan como fusógenos esquivos.Los estudios de coinmunoprecipitación en células HEK293T revelaron una interacción entre IZUMO1 de longitud completa y SPACA632.Sin embargo, nuestros ectodominios recombinantes no interactuaron in vitro, lo que sugiere que las interacciones observadas en Noda et al.Ambos fueron eliminados en la construcción (obsérvese la cola citoplásmica de IZUMO1, que se ha demostrado que es innecesaria para la fertilización).Alternativamente, IZUMO1 y/o SPACA6 pueden requerir entornos de unión específicos que no reproducimos in vitro, como conformaciones fisiológicamente específicas o complejos moleculares que contienen otras proteínas (conocidas o aún no descubiertas).Aunque se cree que el ectodominio IZUMO1 media la unión de los espermatozoides al óvulo en el espacio perivitelino, el propósito del ectodominio SPACA6 no está claro.
La estructura de SPACA6 revela varias superficies conservadas que pueden estar involucradas en interacciones proteína-proteína.La parte conservada de la región bisagra inmediatamente adyacente al motivo CXXC (designada Parche 1 arriba) tiene varios residuos aromáticos orientados hacia afuera que a menudo están asociados con interacciones hidrofóbicas y de apilamiento π entre biomoléculas.Los lados anchos del dominio similar a Ig (región 2) forman un surco cargado positivamente con residuos de Arg e His altamente conservados, y los anticuerpos contra esta región se han utilizado previamente para bloquear la fusión de gametos 30.El anticuerpo reconoce el epítopo lineal 212RIRPAQLTHRGTFS225, que tiene tres de los seis residuos de arginina y His220 altamente conservado.No está claro si la disfunción se debe al bloqueo de estos residuos específicos o de toda la región.La ubicación de esta brecha cerca del extremo C del sándwich β indica interacciones cis con proteínas de esperma vecinas, pero no con proteínas de ovocitos.Además, la retención de una maraña rica en prolina altamente flexible (sitio 3) dentro de la bisagra puede ser el sitio de una interacción proteína-proteína o, más probablemente, indicar la retención de flexibilidad entre los dos dominios.El género es importante para el papel desconocido de SPACA6.Fusión de gametos.
SPACA6 tiene propiedades de proteínas de adhesión intercelular, incluidos los sándwiches β similares a Ig.Muchas proteínas adhesivas (p. ej., cadherinas, integrinas, adhesinas e IZUMO1) poseen uno o más dominios sándwich β que extienden las proteínas desde la membrana celular hasta sus objetivos ambientales63,64,65.El dominio tipo Ig de SPACA6 también contiene un motivo que se encuentra comúnmente en los sándwiches β de adhesión y cohesión: dobletes de hebras paralelas en los extremos de los sándwiches β, conocidos como abrazaderas mecánicas66.Se cree que este motivo aumenta la resistencia a las fuerzas de cizallamiento, lo cual es valioso para las proteínas involucradas en las interacciones intercelulares.Sin embargo, a pesar de esta similitud con las adhesinas, actualmente no hay evidencia de que SPACA6 interactúe con las claras de huevo.El ectodominio SPACA6 no puede unirse a JUNO, y las células HEK293T que expresan SPACA6, como se muestra aquí, apenas interactúan con los ovocitos que carecen de la zona 32.Si SPACA6 establece enlaces intergaméticos, estas interacciones pueden requerir modificaciones postraduccionales o ser estabilizadas por otras proteínas del esperma.En apoyo de esta última hipótesis, los espermatozoides con deficiencia de IZUMO1 se unen a los ovocitos, lo que demuestra que otras moléculas además de IZUMO1 están involucradas en el paso de adhesión de los gametos 27 .
Muchas proteínas de fusión virales, celulares y del desarrollo tienen propiedades que predicen su función como fusógenas.Por ejemplo, las glicoproteínas de fusión virales (clases I, II y III) tienen un péptido o bucle de fusión hidrófobo al final de la proteína que se inserta en la membrana del huésped.El mapa de hidrofilicidad de IZUMO143 y la estructura (determinada y predicha) de la superfamilia IST no mostraron ningún péptido de fusión hidrófobo aparente.Por lo tanto, si alguna proteína de la superfamilia IST funciona como fusógena, lo hace de una manera diferente a otros ejemplos conocidos.
En conclusión, las funciones de los miembros de la superfamilia de proteínas IST asociadas con la fusión de gametos siguen siendo un misterio tentador.Nuestra molécula recombinante SPACA6 caracterizada y su estructura resuelta proporcionarán información sobre las relaciones entre estas estructuras compartidas y su papel en la unión y fusión de gametos.
La secuencia de ADN correspondiente al ectodominio SPACA6 humano predicho (número de acceso NCBI NP_001303901.1; residuos 27-246) se optimizó con codones para su expresión en células S2 de Drosophila melanogaster y se sintetizó como un fragmento de gen con la secuencia que codifica Kozak (Eurofins Genomics)., la señal de secreción de BiP y los extremos 5' y 3' correspondientes para la clonación independiente de la ligadura de este gen en un vector de expresión pMT basado en un promotor de metalotioneína modificado para la selección con puromicina (pMT-puro).El vector pMT-puro codifica un sitio de escisión de trombina seguido de una etiqueta C-terminal 10x-His (Figura S2).
La transfección estable del vector SPACA6 pMT-puro en células D. melanogaster S2 (Gibco) se realizó de manera similar al protocolo utilizado para IZUMO1 y JUNO43.Las células S2 se descongelaron y se cultivaron en medio de Schneider (Gibco) suplementado con una concentración final de suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (v/v) (Gibco) y antibiótico antimicótico 1X (Gibco).Se sembraron células de pase temprano (3,0 x 106 células) en pocillos individuales de placas de 6 pocillos (Corning).Después de 24 horas de incubación a 27°C, las células se transfectaron con una mezcla de 2 mg del vector SPACA6 pMT-puro y reactivo de transfección Effectene (Qiagen) según el protocolo del fabricante.Las células transfectadas se incubaron durante 72 horas y luego se recogieron con 6 mg/ml de puromicina.Luego se aislaron las células del medio de Schneider completo y se colocaron en medio Insect-XPRESS sin suero (Lonza) para la producción de proteínas a gran escala.Un lote de 1 L de cultivo de células S2 se cultivó hasta 8–10 × 106 ml-1 de células en un matraz Erlenmeyer de polipropileno de fondo plano ventilado de 2 L y luego se esterilizó con una concentración final de CuSO4 500 µM (Millipore Sigma) y se filtró de forma estéril.inducido.Los cultivos inducidos se incubaron a 27°C a 120 rpm durante cuatro días.
El medio acondicionado que contenía SPACA6 se aisló mediante centrifugación a 5660 xga 4 °C seguido de un sistema de filtración de flujo tangencial Centramate (Pall Corp) con una membrana MWCO de 10 kDa.Aplique medio concentrado que contenga SPACA6 a una columna de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) de 2 ml.La resina Ni-NTA se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón A y luego se añadió 1 VC de tampón A para dar una concentración final de imidazol de 50 mM.SPACA6 se eluyó con 10 ml de tampón A suplementado con imidazol hasta una concentración final de 500 mM.Se añadió trombina de clase de restricción (Millipore Sigma) directamente al tubo de diálisis (MWCO 12-14 kDa) a 1 unidad por mg de SPACA6 frente a 1 l de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM (tampón B) para diálisis.) a 4°C durante 48 horas.Luego, el SPACA6 escindido por trombina se diluyó tres veces para reducir la concentración de sal y se cargó en una columna de intercambio catiónico MonoS 5/50 GL de 1 ml (Cytiva/GE) equilibrada con Tris-HCl 10 mM, pH 7,5.El intercambiador de cationes se lavó con 3 CV de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, luego se eluyó SPACA6 con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 500 mM en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 durante 25 CV.Después de la cromatografía de intercambio iónico, SPACA6 se concentró a 1 ml y se eluyó isocráticamente de una columna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) equilibrada con tampón B. Según el cromatograma, se agruparon y concentraron las fracciones que contenían SPACA6.La pureza se controló mediante electroforesis teñida con Coomassie en un gel de SDS-poliacrilamida al 16%.La concentración de proteína se cuantificó mediante absorbancia a 280 nm utilizando la ley de Beer-Lambert y el coeficiente de extinción molar teórico.
Se dializó SPACA6 purificado durante la noche contra fosfato de sodio 10 mM, pH 7,4 y NaF 150 mM y se diluyó a 0,16 mg/ml antes del análisis mediante espectroscopia de CD.El escaneo espectral de CD con una longitud de onda de 185 a 260 nm se recolectó en un espectropolarímetro Jasco J-1500 utilizando cubetas de cuarzo con una longitud de trayectoria óptica de 1 mm (Helma) a 25 °C a una velocidad de 50 nm/min.Los espectros de CD se corrigieron al inicio, se promediaron en 10 adquisiciones y se convirtieron a elipticidad residual media (θMRE) en grados cm2/dmol:
donde MW es el peso molecular de cada muestra en Da;N es el número de aminoácidos;θ es la elipticidad en miligrados;d corresponde a la longitud del camino óptico en cm;Concentración de proteínas en unidades.

 


Hora de publicación: 01-mar-2023