347 Tubos en espiral de acero inoxidable de 12,7 x 1,24 mm, mecanismo molecular de condensación electrostática sincrónica y coagregación de α-sinucleína y tau

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Especificación de tubería de acero inoxidable 347

347 Tubería enrollada de acero inoxidable de 12,7*1,24 mm

Diámetro exterior: 6,00 mm DE hasta 914,4 mm DE, tamaños de hasta 24” NB disponibles en existencia, tubos de acero de tamaño DE disponibles en existencia

Rango de espesor de tubería SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
PESO: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) O tamaño no regular que se adaptará según sea necesario

Tipo: Tubos sin costura SS 347 |Tuberías SS 347 REG |Tubos soldados SS 347 |Tuberías fabricadas SS 347 |Tubos SS 347 CDW, tubos LSAW / Soldados con costura / Redibujados

Forma: Tubos/tubos redondos SS 347, Tubos/tubos cuadrados SS 347, Tubos/tubos rectangulares SS 347, Tubos en espiral SS 347, Forma de “U” SS 347, Bobinas tipo Pan Cake SS 347, Tubos hidráulicos SS 347

Longitud: Aleatorio simple, Aleatorio doble y Longitud requerida Extremo: Extremo liso, extremo biselado, pisado

Protección de extremos: Tapas de plástico |Acabado exterior: 2B, No.4, No.1, No.8 Acabado tipo espejo para tubos de acero inoxidable, acabado según los requisitos del cliente

Condición de entrega: recocido y decapado, pulido, recocido brillante, estirado en frío

Inspección, informes de pruebas: certificados de pruebas de fábrica, EN 10204 3.1, informes químicos, informes mecánicos, informes de pruebas de PMI, informes de inspección visual, informes de inspección de terceros, informes de laboratorio aprobados por NABL, informes de pruebas destructivas, informes de pruebas no destructivas

Embalaje: Embalado en cajas de madera, bolsas de plástico, tiras de acero empaquetadas o según las solicitudes de los clientes.

Especiales: Se pueden fabricar tamaños y especificaciones distintos a los anteriores a pedido

Rango de tamaño de tubería SS 347: 1/2 pulgada NB, OD a 24 pulgadas

ASTM A312 347: Tubería austenítica soldada sin costura y con costura recta destinada a altas temperaturas y servicio corrosivo general.No se permite metal de aportación durante la soldadura.

ASTM A358 347: Tubería austenítica soldada por fusión eléctrica para servicio corrosivo y/o de alta temperatura.Normalmente, sólo se producen tuberías de hasta 8 pulgadas según esta especificación.Se permite la adición de metal de aportación durante la soldadura.

ASTM A790 347: Tubería ferrítica/austenítica (dúplex) soldada sin costura y con costura recta destinada a servicios corrosivos generales, con especial énfasis en la resistencia al agrietamiento por corrosión bajo tensión.

ASTM A409 347: Tubería austenítica de pared liviana de gran diámetro, soldada por fusión eléctrica con costura recta o con costura en espiral, en tamaños de 14” a 30” con paredes Sch5S y Sch 10S para materiales corrosivos y/o de alta

ASTM A376 347: Tubería austenítica sin costura para aplicaciones de alta temperatura.

ASTM A813 347: Tubería austenítica de costura simple, soldadura simple o doble para aplicaciones corrosivas generales y de alta temperatura.

ASTM A814 347: Tubería austenítica soldada trabajada en frío para altas temperaturas y servicio corrosivo general.

Composición química de las tuberías de acero inoxidable 347H

Propiedades mecánicas de la tubería de acero inoxidable 347H

Propiedades físicas de las tuberías de acero inoxidable 347H

Grados equivalentes para tubos de acero inoxidable 347H

La agregación de alfa-sinucleína amiloide (αS) es un sello distintivo de la enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías.Recientemente, la proteína tau comúnmente asociada con la enfermedad de Alzheimer se ha asociado con la patología αS ​​y se ha encontrado que colocaliza en inclusiones ricas en αS, aunque el mecanismo molecular de coagregación de las dos proteínas aún no está claro.Aquí informamos que la fase αS se separa en condensados ​​líquidos mediante condensación compleja electrostática con polipéptidos cargados positivamente como tau.Dependiendo de la afinidad de αS por los policationes y la tasa de agotamiento de la valencia de la red de coagulación, los coágulos experimentan una rápida gelificación o coalescencia seguida de una lenta agregación de amiloide.Combinando un conjunto de técnicas biofísicas avanzadas, pudimos caracterizar la separación de fases líquido-líquido αS/Tau e identificar los factores clave que conducen a la formación de agregados heterogéneos que contienen ambas proteínas en un condensado de proteína líquido.
Además de los compartimentos de membrana, la separación espacial en las células también se puede lograr mediante la formación de cuerpos densos similares a líquidos, ricos en proteínas, llamados condensados ​​o gotitas biomoleculares, mediante un proceso conocido como separación de fases líquido-líquido (LLPS).Estas gotitas se forman mediante interacciones temporales multivalentes, generalmente entre proteínas o proteínas y ARN, y cumplen una variedad de funciones en casi todos los sistemas vivos.Una gran cantidad de proteínas con capacidad de LLP exhiben secuencias de baja complejidad que están altamente desordenadas en la naturaleza y en la formación de condensados ​​biomoleculares3,4,5.Numerosos estudios experimentales han revelado la naturaleza flexible, a menudo desordenada y multivalente de las proteínas que forman estos condensados ​​líquidos, aunque se sabe poco acerca de los determinantes moleculares específicos que controlan el crecimiento y la maduración de estos condensados ​​a una forma más sólida. estado..
Los nuevos datos respaldan la hipótesis de que los LLPS aberrantes impulsados ​​por proteínas y la transformación de gotitas en estructuras sólidas pueden ser vías celulares relevantes que conducen a la formación de agregados tóxicos insolubles que a menudo son características de las enfermedades degenerativas.Muchas proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) asociadas a LLPS, a menudo altamente cargadas y flexibles, se han asociado durante mucho tiempo con la neurodegeneración a través del proceso de agregación de amiloide.En particular, se ha demostrado que los condensados ​​de IDP biomoleculares, como FUS7 o TDP-438, o proteínas con grandes dominios de baja complejidad, como hnRNPA19, envejecen hasta adquirir formas similares a geles o incluso sólidas mediante un proceso llamado fluidización.compuesto.a transición de fase sólida (LSPT) en función del tiempo o en respuesta a determinadas modificaciones postraduccionales o mutaciones patológicamente significativas1,7.
Otra PDI asociada con LLPS in vivo es la Tau, una proteína desordenada asociada a microtúbulos cuya agregación amiloide se ha implicado en la enfermedad de Alzheimer10 pero recientemente también se ha implicado en la enfermedad de Parkinson (EP) y otras proteinopatías nucleares sinápticas 11, 12, 13 están relacionadas.Se ha demostrado que Tau se disocia espontáneamente de la solución/citoplasma debido a interacciones electrostáticas favorables14, lo que da como resultado la formación de gotitas enriquecidas con tau conocidas como coacervados electrostáticos.También se ha observado que este tipo de interacción no específica es la fuerza impulsora detrás de muchos condensados ​​biomoleculares en la naturaleza15.En el caso de una proteína tau, la agregación electrostática se puede formar mediante agregación simple, en la que regiones de la proteína con carga opuesta desencadenan el proceso de escisión, o mediante agregación compleja mediante interacción con polímeros cargados negativamente, como el ARN.
Recientemente, la α-sinucleína (αS), un IDP amiloide implicado en la EP y otras enfermedades neurodegenerativas conocidas colectivamente como sinucleinopatía17,18, se ha demostrado en modelos celulares y animales19,20 concentrada en condensados ​​de proteínas con un comportamiento similar al de un fluido.Estudios in vitro han demostrado que αS sufre LLPS por simple agregación a través de interacciones predominantemente hidrofóbicas, aunque este proceso requiere concentraciones de proteínas excepcionalmente altas y tiempos de incubación atípicamente largos19,21.Si los condensados ​​que contienen αS observados in vivo se forman mediante este u otros procesos LLPS sigue siendo una cuestión clave sin resolver.De manera similar, aunque se ha observado agregación de amiloide de αS en neuronas en la EP y otras sinucleinopatías, el mecanismo exacto por el cual αS sufre agregación de amiloide intracelular aún no está claro, ya que la sobreexpresión de esta proteína no parece desencadenar este proceso por sí sola.A menudo se requiere daño celular adicional, lo que sugiere que se requieren ciertas ubicaciones celulares o microambientes para la renucleación de conjuntos de amiloide αS intracelular.Un entorno celular que es particularmente propenso a la agregación puede ser el interior de los condensados ​​de proteínas 23 .
Curiosamente, se ha descubierto que αS y tau se co-localizan en inclusiones características de enfermedades en humanos con enfermedad de Parkinson y otras sinucleinopatías 24,25 y experimentos han informado una relación patológica sinérgica entre las dos proteínas 26,27, lo que sugiere una relación potencial entre la agregación αS y tau en enfermedades neurodegenerativas.enfermedad.Se ha descubierto que αS y tau interactúan y promueven la agregación mutua in vitro e in vivo 28,29 y se han observado agregados heterogéneos compuestos de estas dos proteínas en el cerebro de pacientes con sinucleinopatías 30 .Sin embargo, se sabe poco sobre las bases moleculares de la interacción entre αS y tau y el mecanismo de su coagregación.Se ha informado que αS interactúa con tau a través de una atracción electrostática entre la región C-terminal altamente cargada negativamente de αS y la región central rica en prolina de tau, que también está enriquecida en residuos cargados positivamente.
En este estudio, mostramos que αS de hecho puede disociarse en gotas mediante condensación de complejos electrostáticos en presencia de proteína tau, en contraste con su interacción con otros polipéptidos cargados positivamente como la poli-L-lisina (pLK), y en este proceso.αS actúa como una molécula de andamio para la red de gotitas.Hemos identificado diferencias notables en el proceso de maduración de coacervados αS electrostáticos, que están asociadas con diferencias en la valencia y fuerza de la interacción de las proteínas involucradas en la red de coacervados.Curiosamente, observamos la coagregación de proteínas amiloides αS y tau en coacervados líquidos de larga duración e identificamos algunos factores clave que conducen a la coagregación de estas dos proteínas en dichos coacervados.Aquí describimos en detalle este proceso, que es un posible mecanismo molecular subyacente a la colocalización de dos proteínas en inclusiones específicas de la enfermedad.
αS tiene una cola C-terminal altamente aniónica a pH neutro (Fig. 1a), y planteamos la hipótesis de que podría sufrir LLPS a través de la condensación de complejos electrostáticos con moléculas polipeptídicas policatiónicas desordenadas.Utilizamos una poli-L-lisina (pLK) de 100 residuos como molécula modelo inicial debido a su naturaleza polimérica desordenada y cargada positivamente a un pH neutro de 32. Primero, confirmamos que pLK interactúa con el dominio Ct de αS mediante espectroscopia de RMN en solución. (Figura 1b) utilizando αS marcado con 13C / 15N en presencia de proporciones molares crecientes de αS:pLK.La interacción de pLK con el dominio Ct de αS se manifiesta en perturbaciones del desplazamiento químico y una disminución de la intensidad máxima en esta región de la proteína.Curiosamente, cuando mezclamos αS con pLK en una concentración de αS de aprox.5–25 µM en presencia de polietilenglicol (5–15% PEG-8) (tampón LLPS típico: HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, PEG-8 15%) inmediatamente pasamos por un amplio campo de formación de proteínas. .Las gotitas se observaron mediante microscopía de fluorescencia (WF) y de campo brillante (BF) (Fig. 1c).Gotas de 1-5 µm que contienen αS concentrado (agregado αS 1 µM marcado con AlexaFluor488, AF488-αS), sus propiedades electrostáticas se pueden derivar de su resistencia al 10% de 1,6-hexanodiol (1,6-HD) y su sensibilidad a un aumento en la concentración de NaCl (Fig. 1c).La naturaleza fluida de los coacervados del complejo electrostático αS/pLK se demuestra por su capacidad de fusionarse en milisegundos (Fig. 1d).Utilizando turbidimetría, cuantificamos la formación de gotas en estas condiciones, confirmamos la naturaleza electrostática de la interacción principal asociada con su estabilidad (Fig. 1e) y evaluamos el efecto de varias proporciones de polímeros en el proceso LLPS (Fig. 1f).Aunque la formación de gotas se observa en una amplia gama de proporciones de polímeros, el proceso es muy favorable cuando pLK excede a αS.También se han observado LLP utilizando el agente desplazante químicamente diferente dextrano-70 (70 kDa) o utilizando una variedad de formatos de muestra, incluidas gotas para portaobjetos de vidrio, pocillos de microplacas de diversos materiales, capilares Eppendorf o de cuarzo.
a Representación esquemática de diferentes regiones proteicas en las variantes WT-αS y ΔCt-αS utilizadas en este estudio.El dominio N-terminal anfipático, la región hidrofóbica formadora de amiloide (NAC) y el dominio C-terminal cargado negativamente se muestran en azul, naranja y rojo, respectivamente.Se muestra el mapa de Cargo Neto Por Residual (NCPR) de WT-αS.b Análisis de RMN de la interacción αS/pLK en ausencia de grupos macromoleculares.A medida que aumenta la concentración de pLK (las relaciones molares αS:pLK de 1:0,5, 1:1,5 y 1:10 se muestran en verde claro, verde y verde oscuro, respectivamente).c Coacervado αS/pLK (relación molar 1:10) a 25 µM (αS marcado con AF488 1 µM o pLK marcado con Atto647N para imágenes de WF) en tampón LLPS (arriba) o suplementado con NaCl 500 mM (abajo a la izquierda) o después de 10 % 1,6-hexanodiol (1,6-HD; abajo a la derecha).Barra de escala = 20 µm.d Imágenes microscópicas representativas de la fusión de gotitas BF de αS/pLK (relación molar 1:10) a una concentración de 25 μM;Las flechas indican la fusión de gotas individuales (flechas roja y amarilla) en una nueva gota (flecha naranja) en 200 ms).Barra de escala = 20 µm.e Dispersión de luz (a 350 nm) Agregación de αS/pLK en tampón LLPS antes y después de la adición de NaCl 500 mM o 1,6-HD al 10% a αS 25 µM (N = 3 réplicas de muestra, también se indican la media y la desviación estándar).f Imagen BF (arriba) y análisis de dispersión de luz (a 350 nm, abajo) de la agregación de αS/pLK a αS 25 μM con una relación molar creciente de αS:pLK (N = 3 réplicas de muestra, también se indican la media y la desviación estándar).Barra de escala = 10 µm.La barra de escala de una imagen indica la escala de todas las imágenes en un panel.Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
Con base en nuestras observaciones de la condensación del complejo electrostático αS/pLK y observaciones previas de αS como molécula cliente del condensado de tau/ARN a través de la interacción directa con tau31, planteamos la hipótesis de que αS y tau podrían cosegregarse con el disolvente en ausencia de ARN. condensación.a través de complejos electrostáticos, y αS es la proteína de soporte en los coacervados αS/Tau (ver distribución de carga de tau en la Figura 2e).Observamos que cuando se mezclaron αS 10 μM y Tau441 10 μM (que contenían AF488-αS 1 μM y Atto647N-Tau 1 μM, respectivamente) en tampón LLPS, formaron fácilmente agregados de proteínas que contenían ambas proteínas, como se ve por microscopía WF.(Figura 2a).La colocalización de las dos proteínas en las gotitas se confirmó mediante microscopía confocal (CF) (Figura complementaria 1a).Se observó un comportamiento similar cuando se usó dextrano-70 como agente de agregación (Figura complementaria 1c).Usando PEG o dextrano marcado con FITC, encontramos que ambos agentes de aglomeración se distribuyeron uniformemente en las muestras, sin mostrar segregación ni asociación (Figura complementaria 1d).Más bien, sugiere que en este sistema promueven la separación de fases a través de efectos de apiñamiento macromolecular, ya que el PEG es un agente de apiñamiento preferentemente estable, como se observa en otros sistemas de LLP33,34.Estas gotitas ricas en proteínas eran sensibles al NaCl (1 M) pero no al 1,6-HD (10% v/v), lo que confirma sus propiedades electrostáticas (Figuras complementarias 2a, b).Su comportamiento fluido se confirmó mediante la observación de eventos de gotas fusionadas en milisegundos utilizando microscopía BF (Fig. 2b).
a Imágenes de microscopía confocal (CF) de coacervados de αS/Tau441 en tampón LLPS (10 μM de cada proteína, 0,5 μM de αS marcado con AF488 y Tau441 marcado con Atto647N).b Imágenes representativas de contraste de interferencia diferencial (DIC) de eventos de fusión de gotitas αS/Tau441 (10 μM para cada proteína).c Diagrama de fase basado en la dispersión de la luz (a 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de αS 50 µM.Los colores más cálidos indican más dispersión.d Dispersión de la luz de muestras LLPS de αS/Tau441 con una concentración creciente de αS (Tau441 a 5 µM, N = 2–3 repeticiones de muestras como se indica).e Representación esquemática de algunas variantes de la proteína tau y diferentes regiones de la proteína utilizada en este estudio: dominio N-terminal cargado negativamente (rojo), región rica en prolina (azul), dominio de unión a microtúbulos (MTBD, resaltado en naranja) y Espiral del par formador de amiloide.Regiones de filamentos (PHF) ubicadas dentro del MTBD (gris).Se muestra el mapa de cargo neto por residuo (NCPR) de Tau441.f Usando αS marcado con AF488 1 µM y ΔNt- marcado con Atto647N, usando αS o ΔCt-αS marcado con AF488 1 µM en presencia de ΔNt-Tau (arriba, 10 µM por proteína) o K18 (abajo, 50 µM por proteína ) ) ) micrografías de WF condensadas en tampón LLPS o K18.Las barras de escala en una imagen representan la escala de todas las imágenes en un panel (20 m para los paneles a, b y f).Los datos sin procesar para los paneles cyd se proporcionan como archivos de datos sin procesar.
Para probar el papel de αS en este proceso LLPS, primero investigamos el efecto de αS sobre la estabilidad de las gotas mediante nefelometría utilizando concentraciones crecientes de NaCl (Fig. 2c).Cuanto mayor es la concentración de sal en las muestras que contienen αS, mayores son los valores de dispersión de la luz (a 350 nm), lo que indica el papel estabilizador de αS en este sistema LLPS.Se puede observar un efecto similar aumentando la concentración de αS (y por tanto la relación αS:Tau441) a aprox.Aumento de 10 veces en relación con la concentración de tau (5 µM) (Fig. 2d).Para demostrar que αS es una proteína de andamio en coacervados, decidimos investigar el comportamiento del mutante Tau alterado por LLPS, que carece de una región N-terminal cargada negativamente (residuos 1 a 150, ver Fig. 2e) llamada ΔNt-Tau.La microscopía y la nefelometría de WF confirmaron que ΔNt-Tau en sí no se sometió a LLPS (Fig. 2f y Fig. complementaria 2d), como se informó anteriormente 14. Sin embargo, cuando se agregó αS a las soluciones de dispersión de esta variante de Tau truncada, el proceso de LLPS fue completamente restaurado con una densidad de gotas cercana a la densidad de gotas de soluciones de tamaño completo de Tau y αS en condiciones y concentraciones de proteínas similares.Este proceso también se puede observar en condiciones de bajo hacinamiento macromolecular (Figura complementaria 2c).El papel de la región αS C-terminal, pero no de toda su longitud, en el proceso LLPS se demostró mediante la inhibición de la formación de gotas utilizando una variante αS truncada C-terminal que carece de los residuos 104-140 (Fig. 1a) de (ΔCt- Proteína αS) (Fig. 2f y Fig. Suplementaria 2d).La colocalización de αS y ΔNt-Tau se confirmó mediante microscopía de fluorescencia confocal (Figura complementaria 1b).
Para probar más a fondo el mecanismo LLPS entre Tau441 y αS, se utilizó una variante de Tau adicional, a saber, el fragmento del núcleo de filamento helicoidal emparejado (PHF) en el dominio de unión a microtúbulos (MTBD), que si contiene cuatro dominios repetidos característicos, comúnmente también conocidos. como el fragmento K18 (ver Fig. 2e).Recientemente se ha informado que αS se une preferentemente a una proteína tau ubicada en un dominio rico en prolina en una secuencia que precede al dominio de unión a microtúbulos.Sin embargo, la región PHF también es rica en residuos cargados positivamente (ver Figura 2e), especialmente lisina (15% de residuos), lo que nos llevó a probar si esta región también contribuye a la condensación del complejo αS/Tau.Observamos que K18 por sí solo no podía desencadenar LLPS en concentraciones de hasta 100 μM en las condiciones probadas (tampón LLPS con 15% de PEG o 20% de dextrano) (Figura 2f).Sin embargo, cuando agregamos αS 50 µM a K18 50 µM, se observó mediante nefelometría (Fig. 2d complementaria) y microscopía WF (Fig. 2f) una rápida formación de gotitas de proteína que contienen K18 y αS.Como se esperaba, ΔCt-αS no pudo restaurar el comportamiento LLPS de K18 (Fig. 2f).Observamos que la agregación de αS/K18 requiere concentraciones de proteína ligeramente más altas para inducir LLPS en comparación con αS/ΔNt-Tau o αS/Tau441, en igualdad de condiciones.Esto es consistente con una interacción más fuerte de la región C-terminal αS con el dominio Tau rico en prolina en comparación con el dominio de unión a microtúbulos, como se describió anteriormente 31 .
Dado que ΔNt-Tau no puede realizar LLPS en ausencia de αS, elegimos esta variante de Tau como modelo para caracterizar αS/Tau LLPS dada su simplicidad en sistemas LLPS con Tau de longitud completa (isotipo, Tau441/Tau441).con procesos de agregación complejos (heterotípicos, αS/Tau441).Comparamos el grado de agregación de αS (como parte de la proteína de fase condensada, fαS,c) en los sistemas αS/Tau y αS/ΔNt-Tau mediante centrifugación y análisis SDS-PAGE en fase dispersa (ver 2e), encontramos valores muy similares. ​​para todas las proteínas en la misma concentración.En particular, obtuvimos fαS,c 84 ± 2% y 79 ± 7% para αS/Tau y αS/ΔNt-Tau, respectivamente, lo que sugiere que la interacción heterotípica entre αS y tau es superior a la interacción entre moléculas de tau.entre.
La interacción con varios policationes y el efecto del proceso de condensación en la cinética de αS se estudiaron por primera vez mediante el método de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP).Probamos los coacervados αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau y αS / pLK (αS 100 μM suplementado con αS AF488-αS 2 μM y Tau441 100 μM o ΔNt-Tau o pLK 1 mM).Los datos se obtuvieron dentro de los primeros 30 minutos después de mezclar los componentes de la muestra.A partir de imágenes FRAP representativas (Fig. 3a, condensación de αS / Tau441) y sus correspondientes curvas de curso temporal (Fig. 3b, Fig. complementaria 3), se puede ver que la cinética de αS es muy similar a la de los coacervados Tau441.y ΔNt-Tau, que es mucho más rápido con pLK.Los coeficientes de difusión calculados para αS dentro del coacervado según FRAP (como lo describen Kang et al. 35) son D = 0,013 ± 0,009 µm2/s y D = 0,026 ± 0,008 µm2/s para αS/Tau441 y αS/ΔNt- para el sistema αS/.pLK, Tau y D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, respectivamente (Fig. 3c).Sin embargo, el coeficiente de difusión αS en la fase dispersa es varios órdenes de magnitud mayor que el de todas las fases condensadas, según lo determinado por espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS, consulte la figura complementaria 3) en las mismas condiciones (tampón LLPS) pero en ausencia de policationes. (D = 8 ± 4 µm2/s).Por lo tanto, la cinética de la traducción de αS se reduce significativamente en los coacervados en comparación con las proteínas en la fase dispersa debido a efectos de apiñamiento molecular pronunciados, aunque todos los coacervados conservan propiedades similares a las de un líquido durante la primera media hora después de su formación, en contraste con la fase tau.Cinética más rápida en el condensado de pLK.
Análisis FRAP a – c de la dinámica de αS (αS marcado con AF488 al 2%) en coacervados electrostáticos.En (a) se muestran imágenes representativas de ensayos FRAP αS/Tau441 por triplicado, donde los círculos rojos indican áreas decoloradas.La barra de escala es de 5 µm.b Curvas FRAP promedio y (c) coeficientes de difusión calculados (D) para 5–6 (N) gotas diferentes de tres experimentos usando αS 100 µM y concentraciones equimolares de Tau441 (rojo) o ΔNt-Tau (azul) o pLK (verde) a diez veces la concentración de LLPS.La desviación estándar de la curva FRAP se muestra en color sombreado.A modo de comparación, el coeficiente de difusión αS en la fase dispersa se determinó por triplicado utilizando espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) (consulte la Figura 3 complementaria y los métodos para obtener más información).d Espectros EPR continuos de banda X de TEMPOL-122-αS 100 μM en tampón LLPS sin ningún policatión (negro) o en presencia de Tau441 100 μM (rojo) o ΔNt-Tau (azul) o pLK 1 mM (verde).El recuadro muestra una vista ampliada de las fuertes líneas de campo donde ocurren los cambios más dramáticos.e Curvas de unión de TEMPOL-122-αS 50 μM con varios policationes en ausencia de LLPS (sin PEG).Se ha demostrado que la amplitud reducida de la banda III en comparación con la banda II (IIII/III) del espectro EPR normalizado aumenta las relaciones molares de Tau441 (rojo), ΔNt-Tau (azul) y pLK (verde).Las líneas coloreadas muestran el ajuste a los datos utilizando un modelo de unión aproximado con n sitios de unión idénticos e independientes en cada curva.Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
Como complemento, investigamos la dinámica de αS en varios coacervados utilizando etiquetado de espín dirigido (SDSL) y resonancia paramagnética electrónica continua (CW-EPR).Este método ha demostrado ser muy útil para informar la flexibilidad y la dinámica de la PDI con una resolución residual realista36,37,38.Para este fin, construimos residuos de cisteína en mutantes Cys individuales y utilizamos la sonda de espín 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxilo (TEMPOL).Los derivados de maleimida los etiquetan.Más específicamente, insertamos sondas TEMPOL en la posición 122 o 24 αS (TEMPOL-122-αS y TEMPOL-24-αS).En el primer caso, nos dirigimos a la región C-terminal de la proteína, que participa en la interacción con los policationes.En cambio, la posición 24 puede brindarnos información sobre la dinámica general de las proteínas en el condensado.En ambos casos, las señales EPR obtenidas para proteínas de la fase dispersa correspondieron a radicales nitróxido en estado de movimiento rápido.Después de la separación de fases en presencia de tau o pLK (TEMOL-αS 100 μM, Tau441 o ΔNt-Tau en una proporción de 1:1 o pLK en una proporción de 1:10), se observó un aumento en la intensidad máxima relativa en el espectro EPR de αS.La línea de pérdida se amplió, lo que indica una cinética de reorientación de αS reducida en las gotas en comparación con la proteína en fase diluida (Fig. 3d, Fig. Suplementaria 4a).Estos cambios son más pronunciados en la posición 122. Mientras que en la posición 24 la presencia de pLK no afectó la cinética de la sonda, en la posición 122 la forma de la línea espectral cambió significativamente (Figura complementaria 4a).Cuando intentamos modelar los espectros en la posición 122 de dos sistemas αS / policatión utilizando el modelo isotrópico (Figura 5a complementaria) comúnmente utilizado para describir la dinámica del IDP38,39 marcado con espín, no pudimos reconstruir los espectros experimentales..Simulación espectral de la posición de contrastes de 24 espines (Figura complementaria 5a).Esto sugiere que existen posiciones preferenciales en el espacio de configuraciones de espín de la región C-terminal de αS en presencia de policationes.Al considerar la fracción de αS en la fase condensada en condiciones experimentales de EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% y 47 ± 4% para αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau y αS/pLK, respectivamente; consulte el suplemento Fig. 2e del análisis de datos c), se puede ver que el ensanchamiento detectado por el método EPR refleja principalmente la interacción de la región C-terminal de αS con varios policationes en la fase condensada (el cambio principal cuando se usa TEMPOL-122- αS), y no la condensación de proteínas.Se observa un aumento de la microviscosidad en la sonda.Como se esperaba, el espectro EPR de la proteína en condiciones distintas a LLPS se restauró por completo cuando se agregó NaCl 1 M a la mezcla (Figura complementaria 4b).En general, nuestros datos sugieren que los cambios detectados por CW-EPR reflejan principalmente la interacción de la región C-terminal de αS con varios policationes en la fase condensada, y esta interacción parece ser más fuerte con pLK que con Tau.
Para obtener más información estructural sobre las proteínas en el coacervado, decidimos estudiar el sistema LLPS utilizando RMN en solución.Sin embargo, solo pudimos detectar la fracción αS que permanece en la fase dispersa, lo que puede deberse a una dinámica de proteínas reducida dentro del coacervado y una fase densa en el fondo de la solución en el análisis de RMN.Cuando analizamos la estructura y la dinámica de la proteína que permanece en la fase dispersa de la muestra de LLPS usando RMN (Fig. 5c, d complementaria), notamos que la proteína se comportaba de manera casi idéntica en presencia de pLK y ΔNt-Tau, ambos de que estaban en la estructura secundaria y la dinámica de la columna vertebral de la proteína, revelada por experimentos sobre el cambio químico secundario y la relajación R1ρ.Los datos de RMN muestran que el extremo C de αS sufre una pérdida significativa de flexibilidad conformacional mientras conserva su naturaleza desordenada, como el resto de la secuencia de proteínas, debido a sus interacciones con policationes.
Dado que el ensanchamiento de la señal CW-EPR observado en la fase condensada TEMPOL-122-αS refleja la interacción de la proteína con policationes, realizamos una titulación EPR para evaluar la afinidad de unión de αS a varios policationes en ausencia de LLPS (sin acumulación de Buffer LLPS), lo que sugiere que las interacciones son las mismas en las fases diluida y concentrada (lo cual se confirma con nuestros datos, Figura complementaria 4a y Figura complementaria 6).El objetivo era ver si todos los coacervados, a pesar de sus propiedades similares a las de los fluidos, exhiben algún comportamiento diferencial subyacente a nivel molecular.Como se esperaba, el espectro de EPR se amplió con el aumento de la concentración de policatión, lo que refleja una disminución en la flexibilidad molecular debido a las interacciones moleculares de todos los socios de interacción casi hasta la saturación (Fig. 3e, Fig. 6 complementaria).pLK logró esta saturación con una relación molar más baja (policatión: αS) en comparación con ΔNt-Tau y Tau441.De hecho, la comparación de los datos con un modelo de unión aproximado que supone n sitios de unión idénticos e independientes mostró que la constante de disociación aparente de pLK (~5 μM) es un orden de magnitud menor que la de Tau441 o ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Aunque se trata de una estimación aproximada, sugiere que αS tiene una mayor afinidad por policationes más simples con regiones continuas de carga positiva.Dada esta diferencia en la afinidad entre αS y varios policationes, planteamos la hipótesis de que sus propiedades líquidas pueden cambiar de manera diferente con el tiempo y, por lo tanto, sufrir diferentes procesos LSPT.
Dado el ambiente altamente poblado dentro del coacervado de proteína y la naturaleza amiloide de la proteína, observamos el comportamiento del coacervado a lo largo del tiempo para detectar posibles procesos de LSPT.Usando microscopía BF y CF (Figura 4), observamos que αS/Tau441 coacerva en gran medida en solución, formando gotas grandes que entran en contacto y humedecen la superficie en el fondo del pozo/portaobjetos como gotas completas, como se esperaba (Figura complementaria .7d);A estas estructuras formadas en el fondo las llamamos “balsas de proteínas”.Estas estructuras permanecieron fluidas ya que conservaban la capacidad de fusionarse (Fig. 7b complementaria) y pudieron verse durante varias horas después de que se activó el LLPS (Fig. 4 y Fig. 7c complementaria).Observamos que el proceso de humectación se ve favorecido en la superficie de materiales hidrófilos en lugar de hidrófobos (Figura complementaria 7a), como se esperaba para coacervados electrostáticos con cargas desequilibradas y, por lo tanto, altos potenciales de superficie electrostáticos.En particular, la coalescencia y el rafting de αS/ΔNt-Tau se redujeron significativamente, mientras que los condensados ​​de αS/pLK se redujeron significativamente (Fig. 4).Durante el corto tiempo de incubación, las gotas de αS/pLK pudieron fusionarse y humedecer la superficie hidrófila, pero este proceso se detuvo rápidamente y después de 5 horas de incubación, solo se observaron eventos de coalescencia limitados y no se observó humectación.– transición gel-goteo.
BF (paneles en escala de grises) y CF (paneles de la derecha, αS marcado con AF488 en verde) representativos de muestras de coacervado que contienen αS 100 µM (etiqueta fluorescente al 1%) en tampón LLPS en presencia de imágenes microscópicas de fluorescencia Tau441 100 µM (arriba) ΔNt -Tau (centro) o pLK 1 mM (abajo) en diferentes tiempos de incubación y alturas focales (z, distancia desde el fondo del pocillo de la placa).Los experimentos se repitieron de 4 a 6 veces de forma independiente entre sí con los mismos resultados.Los coacervados αS/Tau441 se humedecen después de 24 horas, formando balsas más grandes que la imagen.La barra de escala para todas las imágenes es de 20 µm.
Luego preguntamos si los grandes grupos de proteínas similares a fluidos formados en LLPS αS/Tau441 conducirían a la agregación amiloide de cualquiera de las proteínas estudiadas.Seguimos la maduración de las gotas de αS / Tau441 a lo largo del tiempo con microscopía WF en las mismas condiciones que antes, pero usando αS marcado con AF488 1 μM y Tau441 marcado con Atto647N (Fig. 5a).Como era de esperar, observamos una localización completa de las proteínas durante todo el proceso de maduración.Curiosamente, desde ca.Después de 5 horas, se observaron estructuras no circulares más intensas dentro de las balsas, a las que llamamos "puntos", algunas de las cuales estaban colocalizadas con αS y otras enriquecidas en Tau441 (Fig. 5a, flechas blancas).Estas manchas siempre se han observado dentro de las balsas en mayor medida para αS/ΔNt-Tau que para αS/ΔNt-Tau.No hubo puntos distintos en las gotitas de los sistemas pLK y Tau incompetentes para la fusión/humectación.Para probar si estas tinciones que contienen αS y Tau441 son agregados similares a amiloide, realizamos un experimento similar usando microscopía de FQ en el que se marcó Tau441 con Atto647N y se agregó tioflavina-T (ThT) específica de amiloide 12,5 μM desde el principio.teñir.Aunque no se observó tinción con ThT de gotitas o balsas de αS/Tau441 incluso después de 24 h de incubación (Fig. 5b, fila superior: gotitas restantes sobre balsas de proteínas), las estructuras ThT positivas que contenían Atto647N-Tau441 dentro de las balsas eran muy débiles.esto replica el tamaño, la forma y la ubicación de las manchas descritas anteriormente (Fig. 5b, filas media e inferior), lo que sugiere que las manchas pueden corresponder a agregados similares a amiloide formados en coacervados fluidos envejecidos.
WF αS 25 μM en varios tiempos de incubación y alturas focales (z, distancia desde el fondo no unido) en presencia de Tau441 25 μM (αS marcado con AF488 1 μM y Tau441 marcado con Atto647N) en un pocillo de una placa de microscopio con tampón LLPS) .Se repitieron seis experimentos de forma independiente con resultados similares.b Imagen microscópica de CF de αS 25 μM en presencia de Tau441 25 μM (Tau441 marcado con Atto647N 1 μM) y tioflavina-T (ThT) 12,5 μM.Las gotas de proteína ponderadas y las balsas y manchas de proteína depositadas se muestran en las filas superior y media, respectivamente.La fila inferior muestra imágenes de balsas y caídas de 3 réplicas independientes.Las flechas blancas indican puntos positivos para ThT en ambos paneles.La barra de escala para todas las imágenes es de 20 µm.
Para examinar con más detalle los cambios en la red de proteínas coacervadas durante la transición de líquido a sólido, utilizamos imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) y microscopía de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) (Figura 6 y Figuras complementarias 8 y 9).Nuestra hipótesis es que la maduración coacervada de la capa en una estructura proteica agregada más condensada o incluso sólida conduce a un contacto más cercano entre la proteína y la sonda fluorescente adjunta a ella, produciendo potencialmente un efecto de extinción que se manifiesta en una vida útil más corta de la sonda (τ) , como se describió anteriormente40.,41 ,42.Además, para muestras doblemente marcadas (AF488 y Atto647N como colorantes donantes y aceptores de FRET, respectivamente), esta disminución en τ también puede ir acompañada de una condensación de coacervado y un aumento en la eficiencia de FRET (E) durante LSPT.Monitoreamos la formación de balsas y manchas a lo largo del tiempo en muestras LLPS αS/Tau441 y αS/ΔNt-Tau (25 µM de cada proteína en tampón LLPS que contiene 1 µM de AF488 marcado con αS y/o Atto647N marcado con Tau441 o ΔNt-Tau).Observamos una tendencia general en la que la vida útil de la fluorescencia de las sondas AF488 (τ488) y Atto647N (τ647N) disminuyó ligeramente a medida que los coacervados maduraron (Fig. 6 y Fig. complementaria 8c).Curiosamente, este cambio mejoró significativamente para los puntos dentro de las balsas (Fig. 6c), lo que indica que se produjo una mayor condensación de proteínas en los puntos.En apoyo de esto, no se observó ningún cambio significativo en la vida útil de la fluorescencia para las gotas de αS / ΔNt-Tau envejecidas durante 24 h (Figura complementaria 8d), lo que sugiere que la gelificación de las gotas es un proceso distinto del manchado y que no va acompañado de una reorganización molecular significativa. dentro de coacervados.Cabe señalar que los puntos tienen diferentes tamaños y contenido variable en αS, especialmente para el sistema αS/Tau441 (Figura complementaria 8e).La disminución en la vida útil de la fluorescencia puntual estuvo acompañada por un aumento en la intensidad, especialmente para Tau441 marcado con Atto647N (Figura complementaria 8a), y mayores eficiencias de FRET para los sistemas αS/Tau441 y αS/ΔNt-Tau, lo que indica una mayor condensación en LLPS cinco horas. Después de la activación, las proteínas dentro de la electricidad estática se condensaron.En comparación con αS/ΔNt-Tau, observamos valores de τ647N más bajos y algo más altos de τ488 en los puntos αS/Tau441, acompañados de valores de FRET más bajos y no homogéneos.Posiblemente, esto puede estar relacionado con el hecho de que en el sistema αS/Tau441, la abundancia de αS observada y esperada en los agregados es más heterogénea, a menudo subestequiométrica en comparación con Tau, ya que el propio Tau441 también puede sufrir LLPS y agregación (Figura complementaria 8e). .Sin embargo, el grado de coalescencia de las gotas, formación de balsas y, lo que es más importante, agregación de proteínas dentro de coacervados de tipo líquido es máximo cuando tanto Tau441 como αS están presentes.
a Imágenes de microscopía de fluorescencia de por vida (FLIM) de αS/Tau441 y αS/ΔNt-Tau a 25 μM de cada proteína (αS marcada con AF488 1 μM y Tau441 o ΔNt-Tau marcada con Atto647N 1 μM) en tampón LLPS.Las columnas muestran imágenes representativas de muestras de LLPS en diferentes tiempos de maduración (30 min, 5 h y 24 h).El marco rojo muestra la región que contiene manchas αS/Tau441.La esperanza de vida se muestra como barras de colores.Barra de escala = 20 µm para todas las imágenes.b Imagen FLIM ampliada del área seleccionada, que se muestra en el cuadro rojo en el panel a.Los rangos de vida se muestran usando la misma escala de colores que en el panel a.Barra de escala = 5 µm.c Histogramas que muestran AF488 (adjunto a αS) o Atto647N (adjunto a Tau) para diferentes especies de proteínas (gotitas-D-, balsa-R- y moteado-P) identificadas en imágenes FLIM registradas para αS-) distribuciones de tiempo de vida de Tau441 y Muestras de coacervado αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI para D, 29-44 ROI para R y 21-51 ROI para puntos).Los valores medio y mediano se muestran como cuadrados amarillos y líneas negras dentro de los cuadros, respectivamente.Los límites inferior y superior del cuadro representan el primer y tercer cuartil, respectivamente, y los valores mínimo y máximo dentro del rango intercuartil (IQR) de 1,5 veces se muestran como bigotes.Los valores atípicos se muestran como diamantes negros.La significación estadística entre pares de distribuciones se determinó mediante una prueba t de dos muestras, asumiendo varianzas desiguales.Los valores p de la prueba t de dos colas se muestran con asteriscos para cada par de datos comparados (* valor p > 0,01, ** valor p > 0,001, *** valor p > 0,0001, **** Valor p > 0,00001), ns Indica insignificancia (valor p > 0,05).Los valores p exactos se dan en la Tabla complementaria 1 y los datos originales se presentan como archivos de datos sin procesar.
Para demostrar aún más la naturaleza amiloide de las motas/agregados, tratamos muestras de coacervados sin teñir durante 24 horas con altas concentraciones de NaCl (1 M), lo que resultó en la separación de agregados de coacervados de proteínas.Cuando se observaron agregados aislados (es decir, una solución dispersa de agregados) usando microscopía de fuerza atómica (AFM), observamos una morfología predominantemente esférica con una altura regular de aproximadamente 15 nm, que tiende a asociarse en condiciones de alta concentración de sal, similar a el comportamiento de las fibrillas de amiloide típicas debido al fuerte efecto hidrofóbico en la superficie (tenga en cuenta que las fibrillas suelen tener una altura de ~ 10 nm) (Figura complementaria 10a).Curiosamente, cuando se incubaron agregados aislados con ThT en un ensayo de fluorescencia de ThT estándar, observamos un aumento dramático en el rendimiento cuántico de fluorescencia de ThT, comparable al observado cuando el tinte se incubó con fibrillas de amiloide αS típicas (Figura complementaria 10b), lo que sugiere que los agregados coacervados contienen estructuras similares a amiloide..De hecho, los agregados eran tolerantes a altas concentraciones de sal pero sensibles al cloruro de guanidina 4 M (GdnHCl), como las fibrillas de amiloide típicas (Figura complementaria 10c).
A continuación, analizamos la composición de los agregados utilizando fluorescencia de una sola molécula, espectroscopia de correlación cruzada/correlación de fluorescencia específica (FCS/FCCS) y análisis de ráfaga de detección de coincidencia de dos colores (TCCD).Con este fin, aislamos agregados formados después de 24 horas de incubación en 100 μl de muestras de LLPS que contienen αS y Tau441 (ambos 25 μM) junto con αS marcado con AF488 1 μM y Tau441 marcado con Atto647N 1 μM.Diluir la solución agregada dispersa resultante a un estado monomolecular utilizando el mismo tampón libre de PEG y NaCl 1 M (el mismo tampón utilizado para separar los agregados del coacervado) para evitar posibles interacciones electrostáticas entre LLPS y proteínas.En la figura 7a se puede ver un ejemplo de la trayectoria temporal de una sola molécula.El análisis FCCS/FCS (correlación cruzada, CC y autocorrelación, AC) mostró que los agregados que contenían αS y tau eran abundantes en las muestras (ver curva CC en la Fig. 7b, panel izquierdo), y surgió un exceso de proteína monomérica residual como resultado del proceso de dilución (ver curvas AC en la Figura 7b, panel izquierdo).Los experimentos de control realizados en las mismas condiciones de solución utilizando muestras que contienen solo proteínas monoméricas no mostraron curvas CC, y las curvas AC encajan bien con el modelo de difusión de un componente (Ec. 4), donde las proteínas monoméricas tienen los coeficientes de difusión esperados (Fig. 7b). ), panel derecho).El coeficiente de difusión de las partículas agregadas es inferior a 1 µm2/s y el de las proteínas monoméricas es de aproximadamente 1 µm2/s.50–100 µm/s;Los valores son similares a los valores publicados anteriormente para fibrillas de amiloide αS sonicadas y αS monomérico por separado en condiciones de solución similares44.Cuando analizamos los agregados con análisis de explosión TCCD (Fig. 7c, panel superior), encontramos que en cada agregado aislado (heteroagregado αS/Tau), aproximadamente el 60% de los agregados detectados contenían tanto αS como tau, aproximadamente el 30% contenía solo tau, alrededor del 10% de αS solamente.El análisis estequiométrico de los heteroagregados αS/Tau mostró que la mayoría de los heteroagregados estaban enriquecidos en tau (estequiometría inferior a 0,5, el número promedio de moléculas de tau por agregado es 4 veces mayor que el de las moléculas αS), lo cual es consistente con nuestro trabajo observado en FLIM in situ. experimentos..El análisis FRET mostró que estos agregados contenían ambas proteínas, aunque los valores FRET reales en este caso no son de gran importancia, ya que la distribución de fluoróforos en cada agregado fue aleatoria debido a un exceso de proteína no marcada utilizada en el experimento.Curiosamente, cuando realizamos el mismo análisis utilizando la variante Tau madura con deficiencia de agregación de amiloide 45,46 (ver Figura complementaria 11a, b), notamos que aunque la agregación electrostática αS era la misma (Figura complementaria 11c, d), la capacidad de formar agregados dentro del coacervado se redujo drásticamente y FLIM detectó varios puntos en experimentos in situ, y se observaron curvas de correlación cruzada débiles para muestras de agregados aisladas.Sin embargo, para una pequeña cantidad de agregados detectados (solo una décima parte de Tau441), observamos que cada agregado estaba enriquecido en αS que esta variante de Tau, con aproximadamente el 50% de los agregados detectados que contenían solo moléculas de αS, y αS era heterogéneo en exceso. .agregados (ver Fig. 11e complementaria), en contraste con los agregados heterogéneos generados por Tau441 (Fig. 6f).Los resultados de estos experimentos mostraron que, aunque la propia αS es capaz de acumularse con tau dentro del coacervado, la nucleación de tau es más favorable en estas condiciones y los agregados similares a amiloide resultantes pueden actuar como una forma de αS y tau.Sin embargo, una vez que se forma un núcleo rico en tau, las interacciones heterotípicas entre αS y tau se ven favorecidas en los agregados sobre las interacciones homotípicas entre moléculas de tau;También observamos redes de proteínas en coacervados líquidos αS/tau.
a Rastros temporales de fluorescencia representativos de moléculas individuales de agregados aislados formados en coacervados electrostáticos αS / Tau441.Se observaron ráfagas correspondientes a coagregados αS/Tau441 (ráfagas por encima del umbral indicado) en tres canales de detección (emisión de AF488 y Atto647N después de excitación directa, líneas azules y rojas, emisión de Atto647N después de excitación indirecta), FRET, línea violeta).b Análisis FCS/FCCS de una muestra de agregados αS/Tau441 aislados obtenidos de LLPS (panel izquierdo).Las curvas de autocorrelación (AC) para AF488 y Atto647N se muestran en azul y rojo, respectivamente, y las curvas de correlación cruzada (CC) asociadas con agregados que contienen ambos tintes se muestran en violeta.Las curvas AC reflejan la presencia de especies de proteínas monoméricas y agregadas marcadas, mientras que las curvas CC muestran solo la difusión de agregados doblemente marcados.El mismo análisis, pero bajo las mismas condiciones de solución que en puntos aislados, las muestras que contienen solo αS monomérico y Tau441 se muestran como controles en el panel derecho.c Análisis flash de fluorescencia de moléculas individuales de agregados aislados formados en coacervados electrostáticos αS/Tau441.La información de cada agregado encontrado en cuatro repeticiones diferentes (N = 152) se traza frente a su estequiometría, valores de S y eficiencia de FRET (panel superior, la barra de color refleja la ocurrencia).Se pueden distinguir tres tipos de agregados: -agregados solo αS con S~1 y FRET~0, agregados solo Tau con S~0 y FRET~1, y agregados Tau/αS heterogéneos con S intermedio y FRET Estimaciones de la cantidad de ambas proteínas marcadoras detectadas en cada agregado heterogéneo (N = 100) se muestran en el panel inferior (la escala de colores refleja la aparición).Los datos sin procesar se proporcionan en forma de archivos de datos sin procesar.
Se ha informado que la maduración o el envejecimiento de los condensados ​​de proteínas líquidas en estructuras sólidas o gelatinosas con el tiempo están involucrados en varias funciones fisiológicas del condensado47, así como en enfermedades, como un proceso anormal que precede a la agregación de amiloide 7, 48, 49. Aquí Estudiamos la separación de fases y el comportamiento en detalle.LSPT αS en presencia de policationes aleatorios en un ambiente controlado a bajas concentraciones micromolares y condiciones fisiológicamente relevantes (tenga en cuenta que la concentración fisiológica calculada de αS es >1 µM50), siguiendo el comportamiento termodinámico típico del LPS.Descubrimos que αS, que contiene una región C-terminal altamente cargada negativamente a pH fisiológico, es capaz de formar gotitas ricas en proteínas en solución acuosa a través de LLPS en presencia de péptidos desordenados altamente catiónicos como pLK o Tau a través del proceso de electrostático. Condensación compleja en presencia de macromoléculas de agregación.Este proceso puede tener efectos relevantes en el entorno celular donde αS encuentra varias moléculas policatiónicas asociadas con su agregación asociada a enfermedades tanto in vitro como in vivo51,52,53,54.
En muchos estudios, la dinámica de las proteínas dentro de las gotitas se ha considerado como uno de los factores clave que determinan el proceso de maduración55,56.En coacervados electrostáticos αS con policationes, el proceso de maduración aparentemente depende de la fuerza de las interacciones con los policationes, la valencia y la multiplicidad de estas interacciones.La teoría del equilibrio sugiere que un paisaje de equilibrio de dos estados líquidos sería la presencia de una gran gota rica en biopolímeros que impulsan el LLPS57,58.El crecimiento de las gotas se puede lograr mediante la maduración de Ostwald59, la coalescencia60 o el consumo de monómero libre en la fase dispersa61.Para αS y Tau441, ΔNt-Tau o pLK, la mayor parte de la proteína se concentró en el condensado en las condiciones utilizadas en este estudio.Sin embargo, si bien las gotas de tau de tamaño completo se fusionaron rápidamente al humedecerse la superficie, la coalescencia y la humectación de las gotitas fueron difíciles para ΔNt-Tau y pLK, lo que sugiere una rápida pérdida de las propiedades del líquido en estos dos sistemas.Según nuestro análisis FLIM-FRET, las gotitas envejecidas de pLK y ΔNt-Tau mostraron un grado similar de agregación de proteínas (vida útil de fluorescencia similar) que las gotitas originales, lo que sugiere que la red de proteínas original se conservó, aunque más rígida.
Racionalizamos nuestros resultados experimentales en el siguiente modelo (Figura 8).Las gotitas inicialmente formadas temporalmente son a menudo redes de proteínas sin compensación electrostática y, por lo tanto, hay áreas de desequilibrio de carga, especialmente en la interfaz de las gotitas, lo que resulta en gotitas con un alto potencial superficial electrostático.Para compensar la carga (un fenómeno comúnmente conocido como agotamiento de valencia) y minimizar el potencial superficial de las gotitas, las gotitas pueden incluir nuevos polipéptidos de la fase diluida, reorganizar las redes de proteínas para optimizar las interacciones carga-carga e interactuar con otras gotitas.con superficies (mojarse).Las gotitas de αS/pLK, debido a su red proteica más simple (solo interacciones heterotípicas entre αS y pLK) y su mayor afinidad por las interacciones proteína-proteína, parecen ser capaces de equilibrar la carga del condensado más rápidamente;de hecho, observamos una cinética de proteínas más rápida en los coacervados αS/pLK formados inicialmente que en αS/Tau.Después del agotamiento de la valencia, las interacciones se vuelven menos efímeras y las gotas pierden sus propiedades líquidas y se convierten en gotas no inflamables similares a geles con un potencial superficial electrostático bajo (y por lo tanto incapaces de mojar la superficie).Por el contrario, las gotas de αS/Tau son menos eficientes para optimizar el equilibrio de carga de las gotas debido a redes de proteínas más complejas (con interacciones homotípicas y heterotípicas) y a la naturaleza más débil de las interacciones de proteínas.Esto da como resultado gotas que retienen el comportamiento líquido durante períodos prolongados de tiempo y exhiben un alto potencial superficial electrostático que tiende a minimizarse al fusionarse y crecer (minimizando así la relación área de superficie/volumen de las gotas) y al humedecer la sustancia química hidrofílica de la superficie.Esto crea grandes bibliotecas de proteínas concentradas que retienen las propiedades fluidas ya que las interacciones siguen siendo muy transitorias debido a la búsqueda constante de optimización de carga en la red de proteínas.Curiosamente, las formas de Tau truncadas en el extremo N-terminal, incluidas algunas isoformas naturales62, exhiben un comportamiento intermedio, con algunos coacervados envejeciendo con αS hasta convertirse en gotitas parecidas a geles de larga vida, mientras que otros se transforman en grandes condensados ​​líquidos.Esta dualidad en la maduración de los coacervados electrostáticos αS es consistente con estudios teóricos y experimentales recientes de LLPS que han identificado una correlación entre el agotamiento de la valencia y el tamizado electrostático en los condensados ​​como clave para controlar el tamaño del condensado y las propiedades del fluido.Mecanismo 58.61.
Este esquema muestra la supuesta vía de agregación de amiloide para αS y Tau441 a través de LLPS y LSPT.Con regiones adicionales ricas en aniones (rojo) y cationes (azul), los coacervados electrostáticos αS y tau con valencia satisfactoria tienen menor energía superficial y, por lo tanto, menos coalescencia, lo que resulta en un rápido envejecimiento de las gotas.Se consigue un estado de gel estable no aglomerado..Esta situación es muy favorable en el caso del sistema αS/pLK debido a su mayor afinidad y su red de interacción de pares de proteínas más simple, lo que permite una transición rápida similar a un gel.Por el contrario, las gotas con valencia insatisfactoria y, por lo tanto, regiones cargadas de proteínas disponibles para la interacción, facilitan que el coacervado se fusione y humedezca la superficie hidrófila para reducir su alta energía superficial.Esta situación es preferible para los coacervados αS/Tau441, que tienen una red compleja multivalente que consta de interacciones débiles Tau-Tau y αS-Tau.A su vez, los coacervados más grandes retendrán más fácilmente sus propiedades fluidas, lo que permitirá que se produzcan otras interacciones entre proteínas.Con el tiempo, se forman agregados heterogéneos de amiloide que contienen tanto αS como tau dentro del líquido coacervado, que pueden estar relacionados con los que se encuentran en los cuerpos de inclusión, que son características de las enfermedades neurodegenerativas.
Las grandes estructuras fluidas formadas durante la maduración de αS/Tau441 con un entorno proteico altamente congestionado pero dinámico y, en menor medida, coacervados αS/ΔNt-Tau son reservorios ideales para la nucleación de la agregación de proteínas.De hecho, hemos observado la formación de agregados proteicos sólidos en este tipo de coacervados proteicos, que a menudo contienen tanto αS como tau.Hemos demostrado que estos heteroagregados se estabilizan mediante interacciones no electrostáticas, son capaces de unirse a colorantes ThT específicos de amiloide de la misma manera que las fibrillas de amiloide típicas y, de hecho, tienen una resistencia similar a diversas influencias.Se demostró que los agregados de αS/tau formados por LLPS tienen propiedades similares al amiloide.De hecho, la variante madura de Tau deficiente en agregación amiloide se ve significativamente afectada en la formación de estos agregados αS heterogéneos dentro del coacervado electrostático líquido.La formación de agregados de αS/Tau441 se observó solo dentro de los coacervados, que conservaban propiedades similares a las de un líquido, y nunca, si los coacervados/gotitas no alcanzaron el estado de gel.En el último caso, la mayor fuerza de las interacciones electrostáticas y, como resultado, la rigidez de la red proteica impiden los reordenamientos conformacionales necesarios de las proteínas para establecer nuevas interacciones proteicas necesarias para la nucleación amiloide.Sin embargo, esto se puede lograr en coacervados más flexibles, similares a líquidos, que a su vez tienen más probabilidades de permanecer líquidos a medida que aumentan de tamaño.
El hecho de que la formación de agregados dentro de la fase condensada sea preferible en grandes condensados ​​de αS/Tau que en pequeñas gotas que gelifican rápidamente, resalta la relevancia de identificar los factores que controlan la coalescencia de las gotas.Por lo tanto, no sólo existe una tendencia a la separación de fases, sino que también se debe controlar el tamaño del condensado para un funcionamiento adecuado y para la prevención de enfermedades58,61.Nuestros resultados también resaltan la importancia del equilibrio entre LLPS y LSPT para el sistema αS/Tau.Si bien la formación de gotitas puede proteger contra la agregación de amiloide al reducir la cantidad de monómeros proteicos disponibles en condiciones de saturación, como se ha propuesto en otros sistemas63,64, la fusión de gotitas en niveles altos de gotitas puede conducir a la agregación interna de proteínas a través de lentos reordenamientos conformacionales.Redes de proteínas..
En general, nuestros datos enfatizan fuertemente la relevancia de la valencia cohesiva y las interacciones satisfechas/insatisfechas en las redes de caída en el contexto de LSPT.En particular, mostramos que los condensados ​​de αS/Tau441 de longitud completa son capaces de fusionarse y nuclearse de manera eficiente para formar heteroagregados de tipo amiloide que incluyen ambas proteínas y proponemos un mecanismo molecular basado en nuestros resultados experimentales.La coagregación de dos proteínas en el coacervado líquido αS/Tau que informamos aquí puede estar relacionada con la co-localización de dos proteínas en inclusiones, que son características distintivas de la enfermedad, y puede contribuir a comprender la relación entre LLPS y agregación amiloide, allanando el camino para el IDP altamente cargado en la neurodegeneración.
Los mutantes monoméricos WT-αS, cisteína (Q24C-αS, N122C-αS) y las variantes ΔCt-αS (Δ101-140) se expresaron en E. coli y se purificaron como se describió anteriormente.Se incluyó DTT 5 mM en todos los pasos de la purificación de mutantes de cisteína αS para evitar la formación de enlaces disulfuro.Isoforma Tau441 (plásmido obtenido de Addgene #16316), variante ΔNt-Tau (Δ1–150, obtenida clonando IVA con cebadores CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) y variante AggDef-Tau (Δ275–311, purificada con cebador GGCTC5). se cultivaron hasta OD600 = 0,6–0,7 a 37 °C y 180 rpm, y se indujo la expresión con IPTG durante 3 horas a 37 °C.Cosechar las células a 11.500 xg durante 15 min a 4 ° C y lavar con tampón salino que contenga NaCl 150 mM.Resuspender el precipitado en tampón de lisis (20 ml por 1 L de LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 m, copeptina 100 mM).El paso de sonicación se realizó en hielo con una amplitud del 80% durante 10 pulsos (1 min encendido, 1 min apagado).No exceda los 60 ml en una ecografía.Los lisados ​​de E. coli se calentaron a 95 ºC durante 20 minutos, después se enfriaron en hielo y se centrifugaron a 127.000 xg durante 40 minutos.El sobrenadante clarificado se aplicó a una membrana de 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) y se dializó frente a 4 litros de tampón de diálisis (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) durante 10 horas.Se equilibró una columna de intercambio catiónico de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, EE. UU.) con tampón de equilibrio (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).El lisado de tau se filtró a través de un filtro de PVDF de 0,22 µm y se inyectó en la columna a un caudal de 1 ml/min.La elución se llevó a cabo gradualmente, la tau se eluyó con un tampón de elución al 15-30% (MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM).Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y todas las fracciones que contenían una banda con el peso molecular esperado de tau se concentraron usando un filtro centrífugo de 10 kDa y se reemplazaron con un tampón que contenía HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 500 mM y DTT 2 mM para la concentración final de proteína fue de 100 μM.Luego, la solución de proteína se pasó a través de un filtro de PVDF de 0,22 µm, se congeló rápidamente y se almacenó a -80°C.La proteína K18 fue amablemente proporcionada por el Prof. Alberto Boffi.La pureza de la preparación fue >95 % según lo confirmado por SDS-PAGE y MALDI-TOF/TOF.Se marcaron químicamente varias cisteínas con AlexaFluor488-maleimida (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) o TEMPOL-maleimida (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá).fueron confirmados por absorbancia y MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau y K18 se marcaron con residuos de cisteína nativa en las posiciones 191 y 322 usando Atto647N-maleimida (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemania) siguiendo el mismo procedimiento.Los mapas de carga neta por residuo para αS y Tau441 se generaron utilizando CIDER66.
Se disolvió poli-L-lisina sólida (pLK DP 90-110 según NMR del proveedor, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, EE. UU.) en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4 a una concentración de 10 mM, se sonicó el proceso durante 5 minutos en un baño de agua ultrasónico y almacenar a -20°C.PEG-8, dextrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, EE. UU.) y FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, EE. UU.) son solubles en agua y se distribuyen ampliamente en tampón LLPS.La diálisis elimina las sales contaminantes.Luego se filtraron a través de un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,22 μm y se calcularon sus concentraciones utilizando un refractómetro (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, EE. UU.).Las muestras de LLPS se prepararon a temperatura ambiente en el siguiente orden: se mezclaron el tampón y la extrusión y se mezclaron tris(2-carboxietil)fosfina 1 mM (TCEP, Carbosynth, Compton, Reino Unido), 2,2,2,2-(etano- 1, 2-diildinitrilo) ácido tetraacético (EDTA, carboxinto) y una mezcla de inhibidor de proteasa al 1% (PMSF 100 mM, bencimida 1 mM, leupeptina 5 μM).Luego se añaden αS y policationes fusionados (opciones pLK o Tau).Para experimentos de series temporales de tioflavina-T (ThT, Carbosynth, Compton, Reino Unido), utilice la concentración total de ThT para que sea la mitad de la concentración de αS.Mezcle suavemente pero a fondo las muestras para garantizar que sean homogéneas.La concentración de cada componente varió de un experimento a otro, como se describe en la sección Resultados.Se utilizó azida a una concentración del 0,02% (p/v) siempre que la duración del experimento superó las 4 horas.Para todos los análisis que utilizan muestras LLPS, permita que la mezcla se equilibre durante 5 minutos antes del análisis.Para el análisis de dispersión de luz, se cargaron 150 µl de muestras en microplacas de 96 pocillos no vinculantes (µClear®, negro, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) y se cubrieron con una película adhesiva.Los LLP se controlaron midiendo la absorbancia a 350 nm en el centro de la solución en un lector de placas CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado a 25°C y los errores se calcularon como la desviación estándar de la media.La fase diluida se cuantificó mediante centrifugación de la muestra y análisis en gel SDS-PAGE, y la fracción αS en las fases diluida y concentrada se cuantificó en varias soluciones de LLPS.Se preparó una muestra de LLPS de 100 µl que contenía αS ​​marcado con AF488 1 µM mediante mezcla completa seguida de centrifugación a 9600 xg durante 30 minutos, después de lo cual el precipitado generalmente era visible.Los 50 µl superiores del sobrenadante se usaron para la cuantificación de proteínas usando gel SDS-PAGE.Los geles se escanearon con filtros AF488 utilizando un sistema de imágenes de gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) o se tiñeron con tinción de Coomassie y se visualizaron con filtros apropiados.Las bandas resultantes se analizaron utilizando ImageJ versión 1.53i (National Institutes of Health, EE. UU.).Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado en dos experimentos diferentes con resultados similares.
Por lo general, se aplicaron 150 μl de muestras a microplacas de 96 pocillos no vinculantes y se visualizaron a temperatura ambiente en un microscopio invertido Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).Para experimentos puntuales, también se utilizaron placas de angiogénesis µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania) o microplacas de poliestireno de 96 pocillos (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Se utilizaron lámparas halógenas EL6000 o de halogenuros metálicos de mercurio como fuentes de iluminación (para imágenes BF/DIC y WF, respectivamente).Para la microscopía WF, se utilizó un objetivo de aire con aumento de 40x (Leica Microsystems, Alemania) para enfocar la luz en la muestra y recolectarla.Para muestras marcadas con AF488 y ThT, filtre la excitación y la emisión con conjuntos de filtros GFP estándar, filtros de paso de banda de excitación y emisión, respectivamente, filtros de paso de banda de 460–500 nm y 512–542 nm, y un espejo dicroico de 495 nm.Para las muestras etiquetadas con Atto647N, se utilizó un conjunto estándar de filtros Cy5 con filtros de paso de banda de excitación y emisión de 628–40 nm y 692–40 nm, respectivamente, y un espejo dicroico de 660 nm.Para microscopía BF y DIC, utilice el mismo objetivo de recogida de luz reflejada.La luz recogida se registró en una cámara CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Alemania).El tiempo de exposición fue de 50 ms para imágenes de microscopía BF y DIC y de 20 a 100 ms para imágenes de microscopía WF.A modo de comparación, el tiempo de exposición para todos los experimentos con ThT fue de 100 ms.Se realizaron experimentos de lapso de tiempo para visualizar la coalescencia de las gotas, recogiéndose imágenes cada 100 ms durante varios minutos.Se utilizó ImageJ (NIH, EE. UU.) para el análisis de imágenes.Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado con resultados similares.
Para los experimentos de colocalización, FRAP y reconstrucción 3D, las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 880 utilizando una edición azul ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).Se aplicaron muestras de 50 µl a placas de Petri µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemania), se trataron con un polímero hidrófilo (ibiTreat) y se montaron en un objetivo de inmersión en aceite de 63 × (Plan-Apochroma 63 ×/NA 1.4 Oil). en DIC).Las imágenes se adquirieron utilizando líneas láser de argón de 458 nm, 488 nm y 633 nm con una resolución de 0,26 µm/píxel y un tiempo de exposición de 8 µs/píxel para ventanas de detección de excitación y emisión de 470–600 nm, 493–628 nm. y se utilizó 638–755 nm para visualizar ThT, AF488 y Atto647N, respectivamente.Para los experimentos FRAP, se grabaron fotografías a intervalos de cada muestra a 1 fotograma por segundo.Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado a temperatura ambiente con resultados similares.Todas las imágenes se analizaron utilizando el software Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).Las curvas FRAP se normalizaron, trazaron y ajustaron a los datos de intensidad/tiempo extraídos de las imágenes usando Zen 2 usando OriginPro 9.1.Las curvas de recuperación se ajustaron a un modelo monoexponencial para tener en cuenta la difusión molecular con un término exponencial adicional para tener en cuenta el efecto blanqueador de adquisición.Luego calculamos D utilizando el radio de blanqueo nominal y la vida media de recuperación determinada previamente como en la ecuación de Kang et al.5 35 mostrado.
Se sintetizaron variantes de cisteína única de αS con 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxilo (TEMPOL) en las posiciones 24 (TEMPOL-24-αS) y 122 (TEMPOL-122-αS), respectivamente.Marcado por giro Para los experimentos de EPR, la concentración de αS se estableció en 100 μM y la concentración de PEG fue del 15 % (p/v).Para diversas condiciones de agregación, la relación αS:pLK fue de 1:10, mientras que las relaciones αS:ΔNt-Tau y αS:Tau441 se mantuvieron en 1:1.Para experimentos de titulación de unión en ausencia de hacinamiento, TEMPOL-122-αS se mantuvo a 50 μM y los policationes se titularon en concentraciones crecientes, preparando cada condición por separado.Las mediciones de CW-EPR se llevaron a cabo utilizando un espectrómetro de banda X Bruker ELEXSYS E580 equipado con un resonador Bruker ER4118 SPT-N1 que funciona a una frecuencia de microondas (SHF) de ~9,7 GHz.La temperatura se fijó en 25°C y se controló mediante un criostato de nitrógeno líquido.Los espectros se obtuvieron en condiciones no saturadas a una potencia MW de 4 mW, una amplitud de modulación de 0,1 mT y una frecuencia de modulación de 100 kHz.Las intensidades espectrales se normalizaron para evitar diferencias en las concentraciones de espín entre muestras y una posible reducción de espín debido a concentraciones residuales de agentes reductores en muestras que contienen Tau441 o ΔNt-Tau (presente en las soluciones de proteínas originales).Los valores dados de g se obtuvieron como resultado del modelado espectral EPR realizado utilizando el software Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implementado en Matlab®67.Se utilizaron modelos isotrópicos de uno o dos componentes para modelar los datos.Después de normalizar todas las señales, los residuos se calcularon restando cada simulación del espectro experimental correspondiente.Para el análisis de titulación de unión, se usó la intensidad relativa de la tercera banda con respecto a la segunda banda del espectro EPR normalizado (IIII/III) para controlar la unión de policationes a αS.Para estimar la constante de disociación (Kd), la curva resultante se ajustó a un modelo aproximado suponiendo n sitios de unión idénticos e independientes.
Los experimentos de espectroscopía de RMN se llevaron a cabo utilizando un espectrómetro de RMN Bruker Neo de 800 MHz (1H) equipado con una criosonda y un gradiente Z.Todos los experimentos se realizaron utilizando αS 130–207 µM y los correspondientes equivalentes de αS/ΔNt-Tau y pLK en HEPES 10 mM, NaCl 100 mM, 10% DO, pH 7,4 y se realizaron a 15 °C.Para controlar el LPS mediante RMN, se añadió PEG al 10 % a las muestras premezcladas.El gráfico de perturbación del cambio químico (Fig. 1b) muestra los cambios químicos promedio de 1H y 15N.Los espectros HSQC de αS 2D1H-15N se asignaron en base a una asignación previa (entrada BRMB n.° 25227) y se confirmaron registrando y analizando los espectros 3D de HNCA, HNCO y CBCAcoNH.Los cambios químicos de 13Cα y 13Cβ se calcularon en presencia de ΔNt-Tau o pLK para medir posibles cambios en las tendencias de la estructura secundaria en comparación con los cambios químicos de αS en la conformación de bobina aleatoria pura 68 (Figura complementaria 5c).Las tasas de R1ρ se midieron registrando experimentos hsqctretf3gpsi (obtenidos de la biblioteca Bruker) con retrasos de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 y 800 ms, y las funciones exponenciales se ajustaron a los retrasos de intensidad máxima en diferentes veces para determinar el R1ρ y su incertidumbre experimental.
Se realizaron experimentos de microscopía de fluorescencia de dos colores con resolución temporal en un microscopio confocal de fluorescencia comercial MT200 con resolución temporal (PicoQuant, Berlín, Alemania) con un dispositivo de conteo de fotones individuales correlacionado en el tiempo (TCSPC).El cabezal de diodo láser se utiliza para excitación entrelazada pulsada (PIE), el haz pasa a través de una guía de ondas monomodo y se sintoniza a una potencia láser de 10 a 100 nW para líneas láser de 481 nm y 637 nm medidas después de un espejo dicroico.Esto garantiza una tasa óptima de recuento de fotones, evitando los efectos de aliasing, fotoblanqueo y saturación de fotones.Se colocaron cubreobjetos o placas de angiogénesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania) directamente en agua de inmersión sobre una lente Super Apocromática 60x NA 1.2 con un collar correctivo (Olympus Life Sciences, Waltham, EE. UU.).Se utilizó un espejo dicroico de 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, EE. UU.) como divisor del haz principal.La radiación no enfocada se bloquea mediante un orificio con un diámetro de 50 micrones, luego la radiación enfocada se divide en 2 rutas de detección mediante un divisor de haz 50/50.Frente al detector se utilizaron filtros de emisión de paso de banda (Semrock, Lake Forest, IL, EE. UU.) 520/35 para tinte verde (AF488) y 690/70 para tinte rojo (Atto647N).Como detectores se utilizaron diodos de avalancha de fotón único (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia).Tanto la recopilación como el análisis de datos se realizaron utilizando el software SymphoTime64 disponible comercialmente (PicoQuant GmbH, Berlín, Alemania).
Se aplicaron cincuenta microlitros de muestras de LLPS a pocillos de angiogénesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania).Las imágenes resultantes se enfocan a 20 µm por encima del fondo del pozo para una distancia de trabajo objetiva óptima para gotas suspendidas y a ~1 µm para balsas y puntos con una resolución axial de al menos 0,25 µm/píxel y un tiempo de retardo de 400 µs/píxel.Seleccione los datos aplicando un umbral de intensidad basado en la intensidad promedio de la señal de fondo (PBG, media + 2σ) para cada canal de modo que solo se seleccionen gotas, balsas o manchas de proteína líquida, filtrando cualquier posible origen de la fase dispersa.Para analizar la vida útil de cada especie (τ) de cada canal (verde, “g” para AF488 y rojo, “r” para Atto647N), seleccionamos regiones de interés (ROI) que contienen gotitas, balsas o manchas (Figura 1 complementaria). ).8b) y los derivó ajustando su desintegración de vida (τD, τR y τP para gotitas, balsas o manchas, respectivamente, consulte la Fig. 8c complementaria) en cada canal utilizando un análisis de ajuste de cola y un modelo de desintegración de dos componentes.Promedio τ de τ .Se excluyeron del análisis los ROI que produjeron muy pocos fotones para un ajuste multiexponencial.El límite utilizado fue <104 fotones para balsas y puntos y 103 para gotas.Las gotas tienen un umbral más bajo porque es difícil obtener curvas de decaimiento con valores de intensidad más altos, ya que las gotas en el campo de la imagen suelen ser más pequeñas y menos numerosas.También se descartaron para el análisis las ROI con recuentos de fotones por encima del límite de acumulación de fotones (establecido en >500 recuentos/píxel).Haga coincidir la curva de caída de intensidad obtenida de la región de interés con una intensidad al 90% del máximo (ligeramente después de la intensidad máxima de la caída) desde el comienzo de la vida útil para garantizar una interferencia IRF mínima mientras se mantiene la misma para todas las caídas de intensidad. Configuraciones Ventana de tiempo relativa Se analizaron de 25 a 50 ROI para balsas y manchas y de 15 a 25 ROI para gotas, imágenes seleccionadas de más de 4 réplicas grabadas de al menos 3 experimentos independientes.Se han utilizado pruebas t de dos colas para evaluar diferencias estadísticas entre especies o entre sistemas coacervados.Para un análisis de la vida útil (τ) píxel por píxel, se calculó la atenuación total de la vida útil sobre el campo para cada canal y se llevó a cabo una aproximación de un modelo de atenuación exponencial de 2/3 componentes.Luego se ajustó la atenuación de vida útil para cada píxel utilizando valores τ calculados previamente, lo que dio como resultado una imagen de ajuste FLIM pseudocolor.El rango de vida útil del ajuste de cola fue el mismo en todas las imágenes del mismo canal, y cada desintegración produjo suficientes fotones para proporcionar un ajuste confiable.Para el análisis FRET, los píxeles se seleccionaron aplicando un umbral de intensidad más bajo de 100 fotones, lo que promedió una señal de fondo (FBG) de 11 fotones.La intensidad de fluorescencia de cada canal se corrigió mediante factores de corrección determinados experimentalmente: 69 diafonía espectral α fue 0,004, excitación directa β fue 0,0305, eficiencia de detección γ fue 0,517.Luego, la eficiencia de FRET a nivel de píxel se calcula utilizando la siguiente ecuación:
donde FDD es la intensidad de fluorescencia observada en el canal donante (verde), FDA es la intensidad de fluorescencia observada en el canal aceptor (rojo) bajo excitación indirecta y FAA es la intensidad de fluorescencia observada en el canal aceptor (rojo) bajo excitación directa ( TARTA).Se observan pulsos de intensidad de fluorescencia en el canal).
Coloque 100 µl de soluciones de reacción LLPS que contengan Tau441 monomérico sin marcar 25 µM (con o sin αS 25 µM) en tampón LLPS (complementado como arriba) en microplacas de 96 pocillos no vinculantes con revestimiento de lámina adhesiva y se verificó la formación de gotas mediante microscopía WF después equilibrio.dentro de 10 min.Después de 48 horas de incubación a temperatura ambiente, se confirmó la presencia de balsas y manchas de proteínas.Luego retire con cuidado el líquido sobre las balsas de los pocillos, luego agregue 50 litros de tampón de disociación (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 1 M, DTT 1 mM) e incube durante 10 minutos.La alta concentración de sal garantiza que el LLPS no se repetirá debido al PEG residual y que se desmontarán posibles conjuntos de proteínas formados únicamente por interacciones electrostáticas.Luego se raspó cuidadosamente el fondo del pocillo con la punta de una micropipeta y la solución resultante se transfirió a un pocillo de observación vacío.Después de la incubación de las muestras con ThT 50 μM durante 1 h, se comprobó la presencia de manchas aisladas mediante microscopía WF.Preparar fibrillas de αS sonicadas incubando 300 l de una solución de αS de 70 µM en PBS con pH 7,4, azida sódica al 0,01% a 37 °C y 200 rpm en un agitador orbital durante 7 días.Luego, la solución se centrifugó a 9600 xg durante 30 min, el sedimento se resuspendió en PBS pH 7,4 y se sonicó (1 min, 50 % de ciclo, 80 % de amplitud en un sonicador Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, EE. UU.) muestras de fibrillas. con una distribución de tamaño relativamente uniforme de pequeñas fibrillas.
El análisis FCS/FCCS y la detección de coincidencia de dos colores (TCCD) se realizaron en el mismo microscopio confocal fluorescente de resolución temporal MT200 (Pico-Quant, Berlín, Alemania) utilizado para los experimentos de microscopía FLIM-FRET utilizando el modo PIE.La potencia del láser para estos experimentos se añadió a 6,0 µW (481 nm) y 6,2 µW (637 nm).Se eligió la combinación de estas potencias de láser para producir un brillo similar para los pares de fluoróforos utilizados, al mismo tiempo que se lograban tasas de recuento óptimas y se evitaba el fotoblanqueo y la saturación.Tanto la recopilación como el análisis de datos se realizaron utilizando el software SymphoTime64 versión 2.3 disponible comercialmente (PicoQuant, Berlín, Alemania).
Las muestras de agregados de αS/Tau aislados obtenidos usando LLPS se diluyen en tampón de aislamiento hasta la concentración monomolecular adecuada (normalmente una dilución de 1:500, ya que los agregados ya están en concentraciones bajas cuando se aíslan de muestras de coacervado).Las muestras se aplicaron directamente a cubreobjetos (Corning, EE. UU.) recubiertos previamente con una solución de BSA a una concentración de 1 mg/ml.
Para el análisis PIE-smFRET en los canales verde y rojo, se aplicó un umbral de intensidad más bajo de 25 fotones para filtrar señales de baja intensidad causadas por eventos monoméricos (tenga en cuenta que los monómeros superan en número a las muestras agregadas en comparación con los agregados aislados).Este umbral se calculó como cinco veces la intensidad promedio de αS monomérico obtenido del análisis de muestras de monómero puro para seleccionar específicamente agregados para el análisis.El circuito de control PIE, junto con la adquisición de datos TSCPC, ha permitido la aplicación de un filtro de ponderación de por vida que ayuda a eliminar la diafonía espectral y de fondo.La intensidad de la llamarada seleccionada usando los umbrales anteriores se corrigió usando la señal de fondo promedio determinada a partir de los histogramas de ocurrencia versus intensidad/bin de las muestras de solo tampón.Las ráfagas asociadas con grandes agregados suelen ocupar varios intervalos consecutivos en el trazo de tiempo (establecido en 1 ms).En estos casos se optó por un contenedor de máxima resistencia.Para el análisis FRET y estequiométrico se utilizó el factor gamma γ determinado teóricamente (0,517).La diafonía espectral y las contribuciones de excitación directa son insignificantes (determinadas experimentalmente) con la potencia del láser de excitación utilizada.La eficiencia y estequiometría de FRET en una explosión se calcula de la siguiente manera.