ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Tubo soldado dúplex para componente químico de la industria química. La deficiencia de SPECC1L conduce a una mayor estabilidad de las uniones empalmadas y a una reducción del desprendimiento de células de la cresta neural craneal.

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ASTM A790 2507/2205 1,4462/1,4410 tubo soldado con autógena a dos caras para la industria química

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Las células de la cresta neural craneal (CNCC) se desprenden de los pliegues neurales embrionarios y migran a los arcos faríngeos, que forman la mayoría de las estructuras de la parte media de la cara.La disfunción CNCC juega un papel importante en la etiología de la hendidura orofacial, una malformación congénita común.Se han encontrado mutaciones heterocigotas en SPECC1L en pacientes con hendiduras atípicas y sindrómicas.Aquí, informamos una tinción mejorada de los componentes de la unión adhesiva canónica (AJ), β-catenina y E-cadherina en células de eliminación SPECC1L cultivadas, y las micrografías electrónicas muestran la difusión apical-basal de AJ.Para comprender el papel de SPECC1L en la morfogénesis craneofacial, creamos un modelo de ratón deficiente en Specc1l.Los mutantes homocigotos son letales para el embrión y presentan alteraciones del cierre del tubo neural y de la laminación CNCC.La tinción de la proteína AJ aumenta en los pliegues neurales mutantes.Este defecto de AJ es consistente con un defecto en la delaminación CNCC, que requiere la disolución de AJ.Además, los mutantes Specc11 han reducido la señalización de PI3K-AKT y han aumentado la apoptosis.In vitro, una leve inhibición de la señalización de PI3K-AKT en células de tipo salvaje fue suficiente para inducir cambios en AJ.Es importante destacar que los cambios de AJ inducidos por la eliminación de SPECC1L pueden revertirse mediante la activación de la vía PI3K-AKT.En conjunto, estos datos sugieren que SPECC1L, como nuevo regulador de la señalización PI3K-AKT y la biología AJ, es necesario para el cierre del tubo neural y la estratificación del CNCC.
Las células de la cresta neural craneal (CNCC) se localizan en el neuroectodermo dorsal y se desprenden del neuroepitelio de los pliegues neurales en desarrollo mediante un proceso que implica la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT)1,2,3.Las CNCC epiteliales premigratorias alteran las uniones intercelulares y se convierten en CNCC mesenquimales migratorias que llenan el primer y segundo arco faríngeo y forman la mayor parte del cartílago craneofacial.Por lo tanto, los genes que regulan la función CNCC a menudo se ven alterados en la etiología de anomalías congénitas craneofaciales, como las hendiduras orofaciales, que afectan con mayor frecuencia a 1 de cada 800 nacimientos sólo en los EE. UU.Una de las deformidades congénitas8.
La delaminación del CNCC coincide con el cierre del tubo neural anterior entre los 8,5 y 9,5 días de desarrollo embrionario en ratones.Los mutantes de varios genes asociados a la hendidura orofacial de ratón también exhiben alguna forma de defecto del tubo neural, incluidos Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 y Pdgfrα12.Sin embargo, los procesos de cierre del tubo neural y estratificación del CNCC pueden considerarse independientes, ya que el ratón mutante Splotch (Pax3) presenta defectos en el cierre del tubo neural sin ningún efecto sobre la estratificación o migración del CNCC 13,14.Modelos de ratón adicionales con defectos en la disección CNCC y el cierre del tubo neural ayudarán a delinear la base molecular común de estos dos procesos.
El aislamiento de CNCC de células neuroepiteliales requiere la disolución de uniones adhesivas (AJ), que están compuestas por complejos proteicos que contienen, entre otros, E-cadherina, β-catenina, α-E-catenina y α-actinina asociados con filamentos de actina 2 Los estudios de sobreexpresión de E-cadherina en pliegues neurales mostraron una reducción o retraso en la delaminación del CNCC.Por el contrario, la supresión de E-cadherina da como resultado una estratificación temprana15,16.Muchos de los factores que median la EMT durante la estratificación de CNCC son factores de transcripción (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) y proteínas remodeladoras de la matriz extracelular (ECM), como las metaloproteinasas de matriz (MMP); sin embargo, las CNCC son reguladores directos del AJ del citoesqueleto. aún no se sabe.Se sabe que la vía PI3K-AKT antagoniza los niveles de E-cadherina, principalmente a partir de la investigación del cáncer17.Estudios recientes han demostrado que la pérdida de la señalización PI3K-AKT basada en PDGFα en ratones conduce a anomalías craneofaciales, incluidos paladar hendido y defectos del tubo neural12.Sin embargo, la relación entre la vía PI3K-AKT y la estabilidad de AJ tras la estratificación CNCC no está clara.
Anteriormente identificamos SPECC1L como el primer gen mutante en dos personas con una hendidura grave que se extiende desde la boca hasta el ojo, conocida como hendidura oblicua (ObFC) o hendidura de Tessier IV18.Se han identificado mutaciones SPECC1L en dos familias multigeneracionales con el síndrome de Opitz G/BBB autosómico dominante (OMIM #145410), en el que los individuos afectados presentaban hiperdistancia y labio/paladar hendido19, y en una familia con síndrome de sobredistancia de Tibi (OMIM #145420)20 .más de la mitad de los casos de síndrome de Opitz G/BBB están ligados al cromosoma X (OMIM #300000) y son causados ​​por mutaciones en el gen MID1, que codifica la proteína 22 del esqueleto celular asociado a los microtúbulos.Nuestra hipótesis es que SPECC1L, también una proteína asociada con los microtúbulos y el citoesqueleto de actina, puede mediar la señalización necesaria para la remodelación del citoesqueleto de actina durante la adhesión y migración celular 18 .A través de estudios in vitro e in vivo, ahora describimos SPECC1L como un nuevo regulador de la estabilidad de AJ a través de la señalización PI3K-AKT.A nivel celular, la deficiencia de SPECC1L resultó en una disminución en el nivel de la proteína pan-AKT y un aumento en la dispersión apical-basal de AJ, que se eliminó mediante la activación química de la vía AKT.In vivo, los embriones con deficiencia de Specc11 muestran un cierre deficiente del tubo neural y una disección reducida del CNCC.Por lo tanto, SPECC1L funciona en la señalización basada en la adhesión celular altamente regulada, necesaria para la función normal del CNCC durante la morfogénesis facial.
Para caracterizar el papel de SPECC1L a nivel celular, utilizamos la línea celular de osteosarcoma estable U2OS descrita anteriormente deficiente en SPECC1L18.Estas células U2OS estables con eliminación de SPECC1L (kd) tuvieron una disminución moderada (60–70%) en los niveles de transcripciones y proteínas de SPECC1L, junto con defectos en la migración y reorganización del citoesqueleto de actina 18. Por el contrario, una disminución transitoria severa en Se ha demostrado que SPECC1L produce defectos mitóticos 23 .Tras una caracterización adicional, encontramos que nuestras células estables SPECC1L-kd cambiaron la morfología en un grado muy alto de confluencia (Figura 1).Las células de control individuales y las células kd en baja confluencia tenían un aspecto similar (Figura 1A,D).24 horas después de la fusión, las células de control conservaron su forma cúbica (Fig. 1B, E), mientras que las células SPECC1L-kd se alargaron (Fig. 1C, F).El alcance de este cambio en la forma de las células se capturó mediante imágenes en vivo in vivo de células de control y células kd (película 1).Para determinar el papel de SPECC1L en células confluentes, primero examinamos su expresión.Descubrimos que los niveles de proteína SPECC1L aumentaron tras la fusión (Figura 1G), mientras que los niveles de transcripción de SPECC1L no aumentaron (Figura 1H).Además, a medida que aumentaba la densidad celular, la proteína SPECC1L se acumulaba en los límites intercelulares (Fig. 2A-E), con un patrón que se superponía al de la β-catenina asociada a la membrana (Fig. 2A'-E').Dada la asociación de SPECC1L con el citoesqueleto de actina 18,23, planteamos la hipótesis de que SPECC1L interactúa con las uniones adhesivas basadas en actina (AJ).
(AF) Las células de eliminación SPECC1L (DF) se alargan en alta confluencia (F) en comparación con las células U2OS de control (AC).Aquí se muestran tres de los seis puntos de tiempo (T1, T3, T6) que seleccionamos para diferentes densidades celulares.(G) Análisis de transferencia Western que muestra que la proteína SPECC1L está estabilizada en un alto grado de confluencia en comparación con un bajo grado de confluencia en las células de control.La transferencia Western de SPECC1L muestra la banda esperada de 120 kDa y una banda de mayor peso molecular, posiblemente modificada postraduccionalmente (*).El análisis de transferencia Western se realizó en las mismas condiciones para confluencia alta y baja.Se tomaron imágenes de la misma transferencia que muestran SPECC1L en confluencia baja y alta.La misma transferencia se eliminó y se volvió a examinar con anticuerpo β-actina.(H) El análisis cuantitativo de RT-PCR no mostró cambios significativos en los niveles de transcripción de SPECC1L.Las barras de error representan SEM de cuatro experimentos independientes.
(AE) Elegimos seis puntos de tiempo (T1-T6) que representan un rango de densidades celulares para normalizar el análisis de la forma celular y los cambios de AJ en células U2OS con eliminación de SPECC1L (kd).Los primeros cinco de estos puntos de tiempo incluyeron células individuales (T1), fusión del 50-70% de grupos de células pequeñas (T2), fusión sin remodelación de células kd (T3), remodelación de células kd (T4) y cambios de 24 horas.en la forma posterior de las células kd (T5).La proteína SPECC1L estaba predominantemente dispersa en el citoplasma en T1 (A), pero su acumulación se observó en los límites intercelulares en puntos temporales posteriores (B-E, flechas).(FJ) La β-catenina muestra una acumulación similar en los límites intercelulares asociados con el complejo AJ.(A'-E') SPECC1L y β-catenina muestran tinciones superpuestas en los bordes celulares con alta densidad celular (flechas).(F'-J') En células SPECC1L-kd, la tinción con β-catenina parece normal a baja densidad celular (F'-H'), pero se expande a medida que cambia la forma de la célula (I', J'; flechas), lo que indica que AJ han cambiado.Barras = 10 µm.
Luego intentamos determinar el efecto de la deficiencia de SPECC1L en AJ.Utilizamos varios marcadores asociados a AJ, incluidos los componentes canónicos F-actina, miosina IIb, β-catenina y E-cadherina24,25,26,27.Las fibras de estrés de actina aumentaron en las células SPECC1L-kd como se describió anteriormente (Fig. 3A, B) 18.La miosina IIb asociada con filamentos de actina mostró un aumento similar en células SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).La β-catenina asociada a AJ se une a la cadherina en la membrana celular, mostrando un patrón de expresión normal en "panal" en los cubocitos de control (Fig. 3E, G).Curiosamente, en imágenes planas utilizando microscopía confocal, la tinción con β-catenina (Fig. 3E, F) y E-cadherina (Fig. 3G, H) en la membrana celular de células confluentes con deficiencia de SPECC1L mostró patrones prominentes de tinción extendida.Esta expansión de la tinción de β-catenina asociada a AJ en células kd fue más pronunciada en la confluencia, pero pareció preceder a los cambios en la forma de las células (Fig. 2F-J, F'-J').Para determinar la naturaleza física de esta tinción extendida de AJ, examinamos los bordes celulares en la superficie apical-basal de las células SPECC1L-kd U2OS mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Figura 3I, J).En contraste con las células de control (Fig. 3I), que tenían regiones densas en electrones separadas indicativas de AJ (flechas), las células kd (Fig. 3J) mostraron regiones grandes y contiguas de alta densidad electrónica indicativas de AJ a lo largo del plano apicobasal..Además, en las secciones transversales, observamos extensos pliegues de la membrana celular en las células kd (Fig. S1A, B), lo que explica el patrón extendido de las bandas de tinción de β-catenina y E-cadherina (Fig. 3F, H).En apoyo del papel de SPECC1L en AJ, la β-catenina se coinmunoprecipitó con SPECC1L en lisados ​​de células U2OS confluentes (Fig. 3K).Junto con la inmunotinción extendida para los marcadores de AJ, el análisis TEM fue consistente con nuestra hipótesis de que la deficiencia de SPECC1L aumenta la densidad y la varianza apical-basal de AJ.
(AH) Aumento de la tinción de actina F en células kd 48 horas después de la fusión (T6; A, B).Tinción alterada de miosina IIb asociada con actina F (C, D).El patrón suave de tinción de la membrana de β-catenina y E-cadherina en las células de control (E, G) se mejoró en las células SPECC1L-kd (F, H).Barras = 10 µm.(I – J) Micrografías electrónicas que observan la unión intercelular apical-basal.Las células de control muestran distintas regiones densas en electrones que indican uniones adhesivas (I, flechas).Por el contrario, toda la unión apical-basal en las células SPECC1L-kd parecía densa en electrones (J, flechas), lo que indica una mayor densidad y dispersión de las uniones adhesivas.(K) La β-catenina se coinmunoprecipitó con SPECC1L en lisados ​​de células U2OS confluentes.Imagen tomada desde un lugar que representa uno de cuatro experimentos independientes.
Para comprender el papel de SPECC1L en la morfogénesis craneofacial, creamos un modelo de ratón deficiente en Specc1l utilizando dos líneas celulares trampa ES independientes, DTM096 y RRH048 (BayGenomics, CA), que representan el intrón 1 y las transcripciones de Specc1l se capturaron en 15 (Fig. 1). .4A, figura S2).La ubicación genómica del inserto del vector señuelo se determinó mediante secuenciación del genoma completo y se confirmó mediante PCR (Fig. S2).Ambos diseños de trampas genéticas también permitieron la fusión en el marco de los reporteros Specc11-lacZ tras la captura.Por lo tanto, la expresión de lacZ determinada mediante tinción con X-gal se utilizó como indicador de la expresión de Specc11.Ambos alelos mostraron patrones de expresión de lacZ similares, y la trampa del gen DTM096 en el intrón 1 mostró una expresión más fuerte que RRH048 en el intrón 15 (no se muestra).Sin embargo, Specc1l se expresa ampliamente, con una expresión particularmente fuerte en los pliegues neurales en E8.5 (Figura 4B), en el tubo neural y los procesos faciales en E9.5 y E10.5 (Figura 4C,D), y en las extremidades en desarrollo. en E10.5 y ojos (Figura 4D).Anteriormente informamos que la expresión de SPECC1L en el primer arco faríngeo en E10.5 estaba presente en el epitelio y el mesénquima subyacente18, lo que concuerda con el linaje CNCC.Para probar la expresión de SPECC1L en CNCC, realizamos pliegues neurales E8.5 (Figura 4E-J) y secciones de cráneo E9.5 (Figura 4K-).En E8.5, SPECC1L tiñó intensamente los pliegues neurales (Fig. 4E, H), incluidas las células teñidas con marcadores NCC (Fig. 4G, J).En E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) se tiñó fuertemente con CNCC migratorio co-teñido con AP2A (Fig. 4L, M) o SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Representación esquemática del gen Specc11 de ratón que muestra la inserción del vector señuelo en clones celulares ES DTM096 (intrón 1) y RRH048 (intrón 15).(BD) Tinción con lacZ de embriones heterocigotos Specc1lDTM096 que representan la expresión de Specc1l de E8.5 a E10.5.NE = neuroectodermo, NF = pliegue neural, PA1 = primer arco faríngeo.(EP) Inmunotinción SPECC1L con marcadores NCC AP2A y SOX10 en pliegues neurales E8.5 (NF; EJ) y secciones de cráneo E9.5 (KP).La tinción con SPECC1L se observó ampliamente en los pliegues neurales E8.5 (E, H; puntas de flecha), incluidas las células marcadas con AP2A (F, G; puntas de flecha) y SOX10 (I, J; puntas de flecha).En E9.5, SPECC1L tiñó fuertemente las CNCC migratorias (K, N; flechas) etiquetadas como AP2A (L, M; flechas) y SOX10 (O, P; flechas).
El cruce entre ratones heterocigotos Specc1lDTM096/+ y Specc1lRRH048/+ muestra que los dos alelos de trampa genética no son complementarios y que los heterocigotos compuestos y los homocigotos embrionarios para cualquiera de los alelos de trampa genética son letales para el embrión (Tabla S1).Los índices mendelianos indicaron una disminución en la tasa de supervivencia de los heterocigotos al nacer (esperado 1,34 frente a 2,0).Observamos una baja mortalidad perinatal entre los heterocigotos, algunos tenían anomalías craneofaciales (Fig. S3).Sin embargo, la baja penetrancia de estos fenotipos craneofaciales perinatales dificulta el estudio de sus mecanismos fisiopatológicos subyacentes.Por lo tanto, nos centramos en el fenotipo embrionario letal de mutantes homocigotos Specc11.
La mayoría de los embriones mutantes compuestos heterocigotos u homocigotos Specc1lDTM096/RRH048 no se desarrollaron después de E9.5-10.5 (Figs. 5A-D), y el tubo neural no se cerró anteriormente (Figs. 5B, D) y, a veces, se cerró posteriormente (no se muestra). ..Este defecto de cierre del tubo neural craneal se asoció con la mayoría de los DLX2 marcados con CNCC que permanecían en los pliegues neurales en E10.5, lo que indica que no hay disección (Figura 5A'-D').Para determinar si el tamaño total de CNCC también se redujo, etiquetamos líneas CNCC con GFP en nuestras líneas de trampa genética con Wnt1-Cre y ROSAmTmG.Transmitimos GFP+ NCC y GFP- (RFP+) no NCC clasificados a partir de embriones completos.En E9.5, la proporción de CNCC marcadas con GFP ordenadas por flujo no cambió significativamente entre embriones WT y mutantes (no se muestran), lo que indica una especificación CNCC normal.Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la tinción residual de Wnt1-Cre y DLX2 en los pliegues neurales expuestos (Figura 5B') se debió a una estratificación defectuosa de CNCC, posiblemente debido a una mayor densidad o dispersión de las células AJ, como se observa en las células SPECC1L-kd.Utilizamos los marcadores NCC SOX10, AP2A y DLX2 para confirmar la presencia de CNCC en el pliegue neural (Figura 5E-R).En E8.5, se observó tinción del pliegue neural para los tres marcadores NCC en secciones de WT (Fig. 5E, G, I) y mutante Specc1l (Fig. 5F, H, J).En E9.5, mientras los marcadores de NCC teñían la NCC migratoria en secciones WT (Fig. 5M, O, Q), se observó tinción de NCC residual en los pliegues neurales expuestos de embriones mutantes Specc1l (Fig. 5N, P, R).Debido a que SOX10 y DLX2 marcan las CNCC migratorias, este resultado sugiere que las CNCC deficientes en SPECC1L logran una especificación posmigratoria pero no logran migrar desde los pliegues neurales.
La deficiencia de Specc11 conduce a un cierre defectuoso del tubo neural, delaminación de las células de la cresta neural craneal y de las AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrión que porta células migratorias de la cresta neural craneal (CNCC) marcadas con Wnt1-Cre (A').Por el contrario, los embriones mutantes Specc11 muestran pliegues neurales abiertos (B), puntas de flecha) y CNCC que no han migrado (B', puntas de flecha).(C, D') Imágenes de campo brillante (C, D') e inmunotinción (C', D') del marcador CNCC DLX2 de embriones E10.5 WT (C, C') y Specc1l (D, D').En los embriones WT E10.5, los CNCC DLX2 positivos colonizan los arcos branquiales (C', flechas), mientras que en los mutantes persiste una tinción llamativa en los pliegues neurales abiertos (D', flechas) y en los primeros arcos faríngeos (D', flechas).) con algo de tinción (flechas) que indica mala delaminación y migración de CNCC.ER) Se marcaron secciones de embriones mutantes WT y Specc1l en las etapas E8.5 (E – L) y E9.5 (M – R) con marcadores NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) y DLX2 (I, J, Q, R).En E8.5, se observó tinción de NCC en secciones de pliegue neural (NF) de tipo salvaje y mutantes.La cotinción de SOX10 y β-catenina en E8.5 WT (K) y mutante (L) reveló una mayor tinción de β-catenina en los límites celulares de los pliegues neurales.En E9.5, se observó tinción de tipo salvaje de CNCC migratorias (M, O, Q), mientras que en los mutantes, las CNCC no estratificadas tiñeron pliegues neurales abiertos (N, P, R).(S – Z) Análisis de etiquetado de AJ in vivo en secciones coronales de embriones WT y Specc11DTM096/RRH048 con la mutación E9.5.En la esquina superior derecha se muestra un plano de sección aproximado.En secciones de tejidos mutantes, se observó una mayor tinción de actina F (S, T) y miosina IIb (U, V).De manera similar a los resultados in vitro en la Fig. 3, en embriones mutantes, se observó una tinción de membrana mejorada para β-catenina (W, X) y E-cadherina (Y, Z).(AA-BB) Una micrografía electrónica de una sección de un embrión de tipo salvaje que mira más allá del borde de la célula apical-basal muestra una región distinta densa en electrones que indica uniones adhesivas (AA, flechas).Por el contrario, en secciones de embriones mutantes Specc11 (BB, flechas), toda la unión apicobasal es densa en electrones, lo que indica una mayor densidad y dispersión de las uniones adhesivas.
Para probar nuestra hipótesis de que la reducción de las capas se debe a una AJ alterada, examinamos el etiquetado de AJ en los pliegues neurales expuestos de embriones mutantes Specc1l (Fig. 5S-Z).Observamos un aumento en las fibras de estrés de actina (Fig. 5S, T) y un aumento concomitante de la localización de la tinción de miosina IIB en las fibras de actina (Fig. 5U, V).Es importante destacar que observamos una mayor tinción de β-catenina (Fig. 5W, X) y E-cadherina (Fig. 5Y, Z) en los límites intercelulares.También examinamos la tinción con β-catenina de NCC en los pliegues neurales de embriones E8.5 (Fig. 5K, L).La tinción con β-catenina pareció ser más fuerte en los pliegues neurales mutantes Specc1l (Fig. 5L y K), lo que sugiere que habían comenzado los cambios en AJ.En micrografías electrónicas de secciones de cráneo de embriones E9.5, observamos nuevamente un aumento de la tinción difusa densa en electrones en embriones mutantes Specc1l en comparación con WT (Fig. 5AA, BB y S1E-H).En conjunto, estos resultados respaldan nuestros resultados in vitro en células SPECC1L-kd U2OS y sugieren que la tinción aberrante de AJ precede a la estratificación de CNCC en nuestros embriones mutantes.
Dada la conocida relación antagónica entre la actividad de AKT y la estabilidad de E-cadherina,17,28 planteamos la hipótesis de la participación de la señalización de PI3K-AKT.Además, observamos ampollas subepidérmicas en algunos de nuestros embriones mutantes que escaparon de la letalidad (<5%) en E9.5-10.5 y, en cambio, se asentaron alrededor de E13.5 (Fig. S3).Las vesículas subepidérmicas son un sello distintivo de la señalización reducida de PI3K-AKT basada en PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) informaron que la interrupción de la activación de PI3K basada en PDGFRα en embriones mutantes PdgfraPI3K/PI3K produce vesículas subepidérmicas, defectos del tubo neural y fenotipos de paladar hendido.De hecho, los niveles de pan-AKT y Ser473-AKT fosforilado activo se redujeron in vivo en tejidos mutantes Specc1l hasta la detención embrionaria E9.5 (Fig. 6A-D).La disminución de los niveles de Ser473-AKT fosforilada puede deberse enteramente a la disminución de los niveles de pan-AKT in vivo (FIG. 6E) e in vitro (FIG. 6F).Se observó una disminución in vitro solo cuando las células U2OS confluían fuertemente con cambios en la forma celular y la densidad de AJ (Figura 6D).Por lo tanto, nuestros datos sugieren que SPECC1L es un nuevo regulador positivo de la señalización de PI3K-AKT en la morfogénesis craneofacial.
(A – E) Secciones de cráneo E8.5 (A, B) y E9.5 (C, D) o lisados ​​E9.5 de embriones mutantes Specc1l (E) que muestran niveles de reducción activa de proteínas S473-AKT y pan-AKT fosforiladas , en comparación con el control WT.La transferencia Western se realizó en lisados ​​de tipo salvaje y lisados ​​mutantes en las mismas condiciones.Las imágenes mostradas para SPECC1L se tomaron de una transferencia.La misma transferencia se eliminó y se volvió a examinar con anticuerpos anti-pan-ACT y β-actina.Los niveles de Pan-AKT en los pliegues neurales E8.5 (A, B) y los niveles de S473-AKT fosforilada en las secciones del cráneo E9.5 se redujeron significativamente.(F) Los niveles de Pan-AKT se redujeron de manera similar en lisados ​​de células SPECC1L-kd U2OS recolectadas en alta confluencia.Las barras de error representan SEM de tres cuantificaciones de transferencia Western independientes.(GJ) Secciones de embriones WT en E9.5 teñidas con KI67 y caspasa 3 escindida, respectivamente, que muestran proliferación celular (G, G') y poca actividad apoptótica (H, H').Los embriones mutantes Specc11 muestran una proliferación celular comparable (I), pero el número de células que sufren apoptosis aumenta significativamente (J).
Luego examinamos marcadores de proliferación y apoptosis.No observamos ninguna diferencia en la proliferación de embriones E9.5 (Fig. 6E, G en comparación con I) con un índice de proliferación del 82,5% para los mutantes WT y del 86,5% para los mutantes Specc1l medido mediante tinción con KI67 (p <0,56, Fisher's prueba exacta).De manera similar, no observamos ninguna diferencia en la apoptosis medida mediante tinción para caspasa 3 escindida en pliegues neurales en E8.5 hasta la detención del embrión (no se muestra) (no se muestra).Por el contrario, la apoptosis aumentó significativamente en todos los embriones mutantes E9.5 (Fig. 6F, H y J).Este aumento general de la apoptosis es consistente con una reducción de la señalización de PI3K-AKT y una letalidad embrionaria temprana29,30,31.
A continuación, para confirmar un papel causal de la señalización de PI3K-AKT en los cambios de AJ en nuestras células kd, alteramos químicamente la vía en las células kd y de control (Figura 7A-F).Utilizamos como marcador el fenotipo de cambio de forma celular observado en células SPECC1L-kd confluentes, que cuantificamos utilizando la relación entre la dimensión más larga (longitud) y la dimensión vertical correspondiente (ancho).Se espera una proporción de 1 para celdas relativamente redondas o cúbicas (Figura 7G).Además de la forma de las células, también confirmamos el efecto sobre AJ mediante tinción con β-catenina (Fig. 7A'-F').La inhibición de la vía PI3K-AKT utilizando wortmanina fue suficiente para cambiar la forma de las células en las células de control (Figura 7A, C) y AJ (Figura 7A').El activador de PI3K-AKT SC-79 no afectó la forma de las células (FIG. 7A, E) ni la expansión de AJ (FIG. 7A') en las células de control.En las células SPECC1L-kd, una mayor supresión de la vía PI3K-AKT resultó en un aumento de la apoptosis (Fig. 7B, D) y un marcado aumento en la tinción con β-catenina (Fig. 7B'), de acuerdo con nuestros mutantes pesados ​​in vivo.Es importante destacar que la activación de la vía PI3K-AKT mejoró significativamente la forma de las células (Figura 7B, F) y los fenotipos AJ (Figura 7B”).Los cambios en la forma de las células se cuantificaron como relación de redondez celular (CCR) y se compararon para determinar su importancia como se describió anteriormente (FIG. 7G).De hecho, en las células de control (Fig. 7G, CCR = 1,56), el tratamiento con wortmanina fue suficiente para alterar significativamente la forma de las células (Fig. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) en un grado similar al observado. en SPECC1L.-células kd (Fig. 7G, CCR = 3,46).El tratamiento con wortmanina de células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3,60, insignificante) no fue más significativo que el de las células kd no tratadas (Fig. 7G, CCR = 3,46, insignificante) o las células de control tratadas con wortmanina (Fig. 7G)., CCR = 3,46, insignificante) afecta adicionalmente al alargamiento celular (7G, CCR = 3,61, insignificante).Lo más importante es que el activador SC-79 AKT restauró el fenotipo alargado de las células SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Estos resultados confirman que SPECC1L regula la señalización de PI3K-AKT y sugieren que una disminución moderada de SPECC1L afecta la adhesión celular, mientras que una disminución fuerte conduce a la apoptosis (Fig. 8).
(A – F') Células de control (A, C, E) y SPECC1L-kd (B, D, F) tratadas con wortmanina (C, D) inhibidor de la vía PI3K-AKT o activador SC-79 (E, F) Las células de control no tratadas son cúbicas (A) con tinción celular normal de β-cat (A'), mientras que las células kd son alargadas (B) con tinción celular de β-cat aumentada (B').Después de la supresión de la vía PI3K-AKT, las células de control se alargaron (C) con expansión de β-cat (C'), mientras que las células kd comenzaron a sufrir apoptosis (D), similar a nuestros embriones altamente mutados y que muestran β-cat extremadamente mejorado.tinción (D').Después de la activación de la vía PI3K-AKT, las células de control permanecieron cúbicas (E) y tuvieron una tinción normal de β-cat (E'), mientras que las células kd mostraron una forma celular (F) y una tinción de β-cat (F') significativamente mejoradas, lo que indica (G) El grado de cambio de forma celular en (AF) se cuantificó utilizando la relación de redondez celular (CCR) de la dimensión más larga (longitud) y la dimensión vertical correspondiente (ancho) utilizando el software MetaMorph.Las células SPECC1L-kd no tratadas (NT) (CCR = 3,46) fueron significativamente más largas que las células de control (CCR = 1,56, p <6,1 × 10–13).La inhibición del mosto de la vía PI3K-AKT en células de control fue suficiente para provocar un alargamiento similar en la forma celular (CCR = 3,61, p <2,4 x 10-9).De manera similar, la activación de AKT por SC-79 en células SPECC1L-kd restauró el alargamiento celular a niveles de control (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).El tratamiento con wortmanina de células SPECC1L-kd dio como resultado un aumento de la apoptosis pero no un aumento adicional en el cambio de forma celular (CCR = 3,60) en comparación con kd no tratadas (CCR = 3,46, ns) o células de control tratadas con wortmanina (3,61) observadas en .ns = no importa.Se muestran +/- mediciones SEM para 50 celdas.Las diferencias estadísticas se calcularon mediante la prueba t de Student.
(A) Representación esquemática de la inhibición y activación de la vía PI3K-AKT que da como resultado cambios y rescate de AJ, respectivamente.(B) Modelo propuesto para la estabilización de la proteína AKT por SPECC1L.
Los CNCC premigratorios requieren lisis de AJ para separarse de las células neuroepiteliales del pliegue neural anterior1,15,32.El aumento de la tinción de los componentes de AJ y la pérdida de la distribución asimétrica apical-basal de AJ en células deficientes en SPECC1L tanto in vitro como in vivo, combinados con la proximidad física de SPECC1L a β-catenina, sugieren que SPECC1L funciona para mantener adecuadamente la estabilidad local de AJ para músculos de organización.citoesqueleto de actina.La asociación de SPECC1L con el citoesqueleto de actina y β-catenina y el aumento en el número de filamentos de actina condensados ​​en ausencia de SPECC1L es consistente con el aumento observado en la densidad de AJ.Otra posibilidad es que un mayor número de fibras de actina en células deficientes en SPECC1L provoque un cambio en la tensión intercelular.Debido a que el estrés celular afecta la dinámica de AJ 33, los cambios de voltaje pueden resultar en AJ 34 más difuso.Entonces cualquier cambio afectará las capas CNCC.
Wnt1 se expresa en los primeros pliegues neurales que dan lugar a las células de la cresta neural.Por lo tanto, el rastreo del linaje Wnt1-cre marca el NCC35 anterior y migratorio.Sin embargo, Wnt1 también marca clones de tejido cerebral dorsal también derivados de pliegues neurales tempranos 35,36, lo que hace probable que nuestra tinción de mutantes E9.5 para marcadores Wnt1 en pliegues neurales abiertos no sea CNCC.Nuestra tinción positiva para los marcadores NCC AP2A y SOX10 confirmó que los pliegues neurales expuestos de los embriones mutantes Specc11 efectivamente contenían CNCC.Además, dado que AP2A y SOX10 son marcadores de NCC de migración temprana, la tinción positiva indicó que estas células son CNCC posmigratorias que no pueden estratificarse con E9.5.
Nuestros datos sugieren que la regulación molecular de AJ por SPECC1L está mediada por la señalización PI3K-AKT.La señalización de AKT se reduce en células y tejidos deficientes en SPECC1L.Hallazgos de Fantauzzo et al.apoyan un papel directo de la señalización de PI3K-AKT en la morfogénesis craneofacial.(2014) demostraron que la falta de activación de la señalización PI3K-AKT basada en PDGFRα conduce a un fenotipo de paladar hendido.También mostramos que la inhibición de la vía PI3K-AKT es suficiente para cambiar AJ y la forma de las células en las células U2OS.De acuerdo con nuestros hallazgos, Cain et al.37 mostraron que la regulación negativa de la subunidad PI3K α110 en las células endoteliales da como resultado un aumento similar en la tinción de β-catenina pericelular, denominado aumento en el "índice de conectividad".Sin embargo, en las células endoteliales cuyos filamentos de actina ya están altamente organizados, la supresión de la vía PI3K-AKT da como resultado una forma celular laxa.Por el contrario, las células SPECC1L-kd U2OS mostraron una forma celular alargada.Esta diferencia puede ser específica del tipo de célula.Si bien la supresión de la señalización de PI3K-AKT afecta permanentemente al citoesqueleto de actina, el efecto sobre la forma celular está determinado por cambios en la tensión causados ​​por cambios en la densidad y organización de las fibras centrales de actina.En las células U2OS, utilizamos solo cambios en la forma de las células como marcador del cambio y la recuperación de AJ deficiente en SPECC1L.En conclusión, planteamos la hipótesis de que la inhibición de la vía AKT en la deficiencia de SPECC1L aumenta la estabilidad de AJ y reduce la delaminación en CNCC.
Curiosamente, los niveles de pan-AKT se redujeron in vitro e in vivo, además de los niveles de 473-AKT fosforilada en ausencia de SPECC1L, lo que sugiere una regulación de la señalización de PI3K-AKT al nivel de estabilidad o recambio de la proteína AKT.Los genes SPECC1L y MID1, ambos asociados con el síndrome de Opitz/GBBB, codifican proteínas que estabilizan los microtúbulos 18,22.El mecanismo por el cual SPECC1L y MID1 median en la estabilización de los microtúbulos no se comprende completamente.En el caso de SPECC1L, esta estabilización incluye una mayor acetilación de un subconjunto de microtúbulos [18].Es posible que SPECC1L utilice un mecanismo similar para estabilizar otras proteínas como AKT.Se ha demostrado que la acetilación de residuos de lisina en la proteína AKT conduce a una disminución de la localización y la fosforilación de la membrana38.Además, se requiere la ubiquitinación de la cadena K63 en el mismo residuo de lisina en AKT para su localización y activación en la membrana39,40.Entre varios factores que interactúan con las proteínas SPECC1L identificadas en varias pantallas de dos híbridos de levadura de alto rendimiento, cuatro (CCDC841, ECM2942, APC y UBE2I43) han sido implicados en el recambio o la estabilidad de las proteínas mediante ubiquitinación o sumoilación.SPECC1L puede estar involucrado en la modificación postraduccional de los residuos de lisina de AKT, afectando la estabilidad de AKT.Sin embargo, aún no se ha dilucidado el papel fundamental de SPECC1L en la localización y estabilidad de la proteína AKT.
Los defectos graves en la expresión de SPECC1L in vivo dieron como resultado un aumento de la tinción del marcador AJ y una superposición defectuosa de CNCC, así como un aumento de la apoptosis y la letalidad embrionaria temprana.Informes anteriores han demostrado que los ratones mutantes con niveles elevados de apoptosis están asociados con defectos del tubo neural 44,45,46,47 y defectos craneofaciales48.Se ha sugerido que la muerte celular excesiva en los pliegues neurales o los arcos faríngeos puede provocar una cantidad insuficiente de células necesarias para el movimiento morfogenético adecuado 48,49,50.Por el contrario, nuestras líneas celulares deficientes en SPECC1L con expresión de SPECC1L moderadamente reducida mostraron solo cambios en AJ sin evidencia de un aumento de la muerte celular.Sin embargo, la inhibición química de la vía PI3K-AKT en estas células Kd resultó en un aumento de la apoptosis.Por tanto, una disminución moderada en la expresión o función de SPECC1L garantiza la supervivencia celular.Esto es consistente con la observación de que los raros embriones mutantes Specc11 que escapan al arresto en st.Los E9.5, tal vez debido a una menor eficiencia de captura de genes, pueden cerrar sus tubos neurales y detenerse más adelante en el desarrollo, a menudo con defectos craneofaciales (Fig. S3).También es consistente con esto la rara aparición de embriones Specc1l heterocigotos con anomalías craneofaciales, probablemente debido a una mayor eficiencia de captura de genes, así como el hallazgo en el pez cebra en el que uno de los dos ortólogos SPECC1L (specc1lb) causa fenotipos embrionarios tardíos, incluida la pérdida de mandíbulas inferiores y hendiduras bilaterales51.Por lo tanto, las mutaciones heterocigotas de pérdida de función de SPECC1L identificadas en pacientes humanos pueden causar pequeñas alteraciones en la función de SPECC1L durante la morfogénesis craneofacial, suficientes para explicar sus hendiduras orofaciales.La regulación de los contactos intercelulares basada en SPECC1L también puede desempeñar un papel en la palatogénesis y la fusión de los arcos faríngeos.Estudios adicionales de la función de SPECC1L ayudarán a dilucidar el papel de los contactos intercelulares temporales en CNCC durante el cierre del tubo neural en la motilidad de las células neuroepiteliales y la morfogénesis craneofacial.
El control del osteosarcoma U2OS y las células SPECC1L-kd se han descrito previamente (Saadi et al., 2011).Los anticuerpos contra SPECC1L también se han caracterizado previamente (Saadi et al., 2011).Anticuerpos anti-β-catenina (conejo; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (ratón; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherina (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), caspasa 3 escindida (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y β-actina (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se utilizó como se describe..Los filamentos de actina se tiñeron con Acti-stain rodamina faloidina (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Las células de control U2OS y las células SPECC1L-kd se cultivaron en DMEM estándar con alto contenido de glucosa suplementado con suero bovino fetal al 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Para los cambios de AJ, se sembraron 2 x 105 células en vidrio tratado con gelatina porcina al 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se observaron cambios en la forma de las células.Las células se recolectaron en diferentes puntos de tiempo indicados: 4 horas después de la siembra (t = 1), 24 horas después de la siembra (t = 2), confluencia sin cambio en la forma de las células (t = 3), cambio en la forma de las células (t = 4) , 24 h después del cambio de forma de las células (t = 5) y 48 h después del cambio de forma de las células (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Para modular la vía PI3K-AKT, las células se cultivaron en las concentraciones indicadas con el inhibidor de PI3K-AKT wortmanina (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) o el activador SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).El medio que contenía los productos químicos se cambió diariamente.
Se realizaron grabaciones cuadro por cuadro en control vivo y células KD en condiciones de cultivo normales, y se recogieron imágenes de contraste de fase cada 10 minutos durante 7 días.Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio invertido Leica DM IRB controlado por computadora equipado con una platina mecánica y un objetivo N-PLAN de 10 × conectado a una cámara QImaging Retiga-SRV.Durante la obtención de imágenes, los cultivos celulares se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5 % de CO2.
Se utilizaron dos líneas celulares ES de trampa genética DTM096 y RRH048 del Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) para generar líneas de ratones deficientes en Specc11, denominadas Specc1lgtDTM096 y Specc1lgtRRH046.Brevemente, se inyectaron células 129/REJ ES en blastocistos C57BL6.Los ratones macho quiméricos resultantes se cruzaron con ratones hembra C57BL6 para identificar crías con coloración de pelaje agutí.La presencia de inserciones de vectores de trampa genética se utilizó para identificar heterocigotos.Los ratones se mantuvieron en un fondo mixto de 129/REJ;C57BL6.La ubicación del sitio de inserción del vector de trampa genética se confirmó mediante RT-PCR, secuenciación del genoma y complementación genética (Figura 1 complementaria).Para rastrear el linaje CNCC de ratones Specc1lGT doblemente heterocigotos, se cruzaron ratones ROSAmTmG (#007576) y Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) para producir el alelo ROSAmTmG y Wnt1-Cre en embriones mutantes Specc1l.Todos los experimentos en ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Kansas.
Los embriones se fijaron en (1% formaldehído, 0,2% glutaraldehído, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) durante 60 minutos a temperatura ambiente.Después de la fijación en solución de tinción X-gal (ferricianuro de potasio 5 mM, ferrocianuro de potasio 5 mM, MgCl2 2 mM, desoxicolato de sodio al 0,01%, NP-40 al 0,02%, X-gal 1 mg/ml) el desarrollo de la tinción se realizó a 37°C .°C en 1-6 horas.Los embriones se fijaron posteriormente en PFA al 4 % y se visualizaron.
Para la transferencia Western, las células se lisaron en tampón de lisis pasiva (Promega, Fitchburg, WI) complementado con una mezcla de inhibidores de proteasa HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Los lisados ​​​​se procesaron en geles preparados Mini-PROTEAN TGX de poliacrilamida al 12% (Bio-Rad, Hercules, CA) y se transfirieron a membranas Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Las membranas se bloquearon en leche al 5% en PBS que contenía Tween al 0,1%.Los anticuerpos se incubaron durante la noche a 4°C o durante una hora a temperatura ambiente.Se utilizó el reactivo Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) para la generación de señales.Para la inmunotinción, los embriones se fijaron durante la noche en PFA/PBS al 4% y se criopreservaron.Las criosecciones de tejido se bloquearon en PBS que contenía suero de cabra normal al 1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) y Triton X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y luego se incubaron a 4°C en una incubadora durante el noche.con anticuerpo y anticuerpo secundario fluorescente (1:1000) durante 1 hora a 4°C.Las secciones teñidas se colocaron en medio de oro ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) y se obtuvieron imágenes planas utilizando un microscopio confocal Leica TCS SPE.Cada inmunotinción se realizó como tres experimentos independientes en cirossecciones de al menos dos embriones mutantes.Se muestra un experimento representativo.
Las células se incubaron en tampón RIPA modificado (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NP-40 al 1%, NaCl 130 mM, glicerol al 10%, EDTA 2 mM e inhibidor de proteasa HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Brevemente, los lisados ​​se purificaron previamente con perlas magnéticas de proteína G (Life Technologies, Carlsbad, CA) y luego se incubaron durante la noche a 4 °C con anti-SPECC1L o proteína IgG. Se usaron perlas de proteína G para extraer SPECC1L y se realizó transferencia Western usando el método anti. Anticuerpo -β-catenina descrito anteriormente. Los experimentos co-IP mostrados son representativos de cuatro experimentos independientes.
Se proporcionaron células cultivadas fijadas o tejidos embrionarios de ratón al centro de microscopía electrónica del Centro Médico de la Universidad de Kansas.Brevemente, las muestras se incluyeron en resina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), se polimerizaron durante la noche a 60 °C y se seccionaron a 80 nm utilizando un ultramicrótomo Leica UC7 equipado con un disco de diamante.Las secciones se visualizaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1400 equipado con una pistola Lab6 de 100 kV.
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